文档介绍：cDNA测序和表达谱研究
适用于教师试讲、学校演讲、教学课件、说课大赛
1. cDNA文库构建
研究目的不同—采用不同的cDNA文库构建方法。
①表达谱分析：常规的cDNA文库，如：oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机与UniGene比较，会过高估计所获得的新EST。
要求：所测EST顺序的长度应大于100bp，错误率或不能识别的碱基小于3％
ORF
一个由能翻译成氨基酸序列的三联体构成的阅读框称为开放读框(Open reading frame)。
一段翻译成蛋白质的序列有一个阅读框架，它有一个特殊的起始密码子(AUG)，从此延伸出一系列代表氨基酸的三联体，一直到终止密码子结束。
3．信息传输、处理和管理
很重要
要有本地(in-house)的工作站、局域网络，
建立实验室信息管理系统(LIMS)及数据库系统，以传输、加工、处理和储存测序结果。
整个流水线的各个环节包括试剂购买、配制、操作步骤、序列分析、菌种及质粒储存等都要有严格的管理制度和质量控制标准。
实现操作规范化、信息传递和处理自动化，
充分利用数据库技术和生物信息学分析工具，尽可能阐明所获得信息的生物学意义，为进一步开发和利用创造条件。
4．生物信息学分析
生物信息学已经成为当代生命科学的重要组成成分，
可用于大量生物信息资源的收集、储存、处理、搜索、共享、研究和开发。
由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成，在基因组计划中发挥了不可取代的作用。
用生物信息学分析所获得的EST测序结果是最重要的环节。
要求：研究者要有渊博的生物学知识、计算机技术和应用互联网资源的能力。
本地的数据库不仅储存、加工自己的EST数据，更重要的是要收集、储存并定期更新来自国际权威机构的核苷酸及蛋白质数据库信息。
要有一些应用软件能进行比较、排列、检索、结构预测。
国际上常用软件系统：GCG(genetics computer group)软件包，有定期更新的核苷酸及蛋白质数据库及二百多个应用软件构成，可基本满足EST序列分析的需要。
EST分类
通过同源性分析，EST至少分为三类：
①代表已知基因的EST
(顺序超过100bp，与已知基因的同源性大于95％)；
②已知的EST
(顺序超过100bp，与已知EST的同源性大于95％)
③新的EST
(顺序超过100bp，与已知基因、EST的同源性
低于95％或没有同源性)。
在组织基因表达谱分析时，要进行统计学分析：
① EST测序过程中，基因克隆数符合Poisson分布
②利用定量基因表达谱分析软件，通过聚类分析，将所测EST大部分可归于不同的UniGene。
UniGene：
①多个EST组成，能相互重叠，可以形成较长的重叠序列。
②按理论，每一个UniGene可能代表一个基因，即聚类分析的目的是将所测EST归于不同基因。
(二)全长cDNA的克隆
全长cDNA的识别和克隆是人类基因组计划的主要目的之一，是进行功能研究的前提。
公共数据库的全长cDNA序列还较少，大部分的全长基因有待于克隆。
尽管EST可能仅是基因的片段，但对基因的鉴定很重要。
EST数量的大量增加，人们可以利用EST资源获得全长cDNA。
EST的利用：
① UniGene数据库
为电脑克隆全长cDNA提供了便利的条件。
②通过IMAGE协会
(the Integrated Molecular Analysis of Genomes and their Expression)
该协会由美国和法国的4个研究机构组成，
目的是收集所有的EST克隆和顺序，并且这些克隆可以提供给研究人员。
大量获得全长cDNA的策略
构建富含全长cDNA的文库和电脑克隆
①构建富含全长cDNA的文库。
如何获得低丰度、长的以及含有特殊结构的转录物成为难题。
cDNA的文库构建方面有了较大的进展：
A. 文库构建所用的反转录酶和Taq酶，其忠实性能和延伸性能有了很大改善，所构建的cDNA的文库含有全长cDNA的克隆超过50％，其长度超过3kb，甚至7kb。
。
B. 根据5’转录帽状结构所设计的特殊cDNA构建策略，其全长cDNA的比例较高。
，除对来自各种组织、细胞的cDNA文库测序外，采取步骤去除已知的或已测过的顺序，如用已知的序列去杂交或吸附等方法处理cDNA文库，以增加低丰度的转录物被测序机会。
也可以先用寡核苷酸指纹印迹法对欲测文库进