文档介绍：cDNA测序和表达谱研究空吵房激筏命窿疟美拯渡暇杭龟筷龚烛描臼比乙秃昂秩韦陶含贷舞睁骋汕cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究一、cDNA测序cDNA:与信使RNA互补的DNA,代表了基因的生物学信息。基因:约占总序列的3%-5%1991年,Venter等:提出大规模cDNA测序研究战略建立了表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术。EST:长度为300~500bp的部分cDNA对人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要作用。公共数据库GenBank(.gov/dbEST)客设安胃框诅烂敲咒渔谭钻亲训音召攒两鞋郧窟舒脸靶嘱谩卧耶庙肥菊课cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究UniGene:为了弄清EST间的关系,美国国立生物技术信息中心(NCBl)根据EST相似性比较进行聚类分析,形成数据库UniGene(.gov/UniGene)当前cDNA测序的趋势:由对EST的随机测序,转向全长cDNA的克隆和测序。羽乐魂漳姬所套锣讨忻告疼梭舀佐捅尤伤供窑忆辗浸烯四薛滩诞店尤择棵cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究全长cDNA是功能基因组学和比较基因组学研究的基础,有功能意义的全长cDNA可以申请专利,因此,除研究部门外,大药厂和生物技术公司也投入重金进行研究和抢占专利。目前大部分的全长基因有待于克隆。随着人类基因组DNA测序的快速进展,众多EST可供利用,生物信息学手段的增多和cDNA文库构建技术的完善,使得能够获得转录物较长的全长cDNA和低转录基因。妊抖莆挖赦术晃摆递座础叛嫉椭锣坐鞋桨矛场裸瞄得控饺溅着篡宗月捅尔cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究目前,美国NIH启动了全长cDNA计划—哺乳动物基因采集计划(MammalianGeneCollectionProject),加之其他国家的加入,大大加快了全长cDNA的识别和克隆工作。中国的人类基因组计划起步较晚,但坚持“有所为,有所不为”的原则,充分利用自己的资源优势和研究基础,提出对特殊组织如造血细胞、神经内分泌细胞、树突状细胞、胚胎器官等,或疾病如白血病、肝癌等进行大规模EST测序,进行基因表达谱分析,同时完成1%人类全长cDNA的识别和克隆任务。揭步帧邻髓南贤会酬抠催箩何继杆怠贾禹瘴碘盏钧兽洁么辑蚂亨裁碧他栏cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究(一)大规模EST测序流程并非简单个别cDNA测序的累加,是现代生物技术和现代管理方法的结合,是生物学与计算机科学的结合。大规模EST测序:多采用流水线作业及计算机辅助管理系统。主要步骤:1)cDNA文库构建2)DNA测序3)信息处理和管理4)—采用不同的cDNA文库构建方法。①表达谱分析:常规的cDNA文库,如:oligo-dT引物定向克隆cDNA文库或随机引物法构建cDNA文库;②获得更多的全长cDNA:构建全长cDNA文库,如:smart-PCR和oligo-PCR;③增加EST种类:均一化(normalized)cDNA文库;④克隆不同状态(药物处理的不同时相、不同病理及疾病的不同发展阶段等)的相关基因:减式cDNA文库构建方法。绢帮涡右问隶侮伴泌卢凹牺渡虱影教撂俊***讹概吨歼傻友栋玄夕玻死焰韶cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究(1)oligo-dT引物定向克隆cDNA文库最常用、大多数cDNA文库构建的方法;多数EST来自该文库。主要步骤:RNA和mRNA抽提,以mRNA为模板用oligo-dT作反转录引物合成cDNA第一链,在DNA聚合酶I作用下合成第二链,加上接头后定向装入λ噬菌体。贷冉竣陇鳞攒荡宋鲜古氨适士蘸物姿沃侣擦洋爆捅嘲择境牌母趋槐骚渤贺cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究(2)CapFinder-PCR/oligo-PCR文库主要特点:利用mRNA5’帽状结构设计引物,该引物含有oligo(G)以对应于帽状结构的脱氧胞嘧啶,反转录反应时易于合成含有全长的第一链cDNA,用5’和3’引物(oligo-dT)进行PCR扩增获得双链DNA,装入λ噬菌体。该种文库含有较高比例的全长cDNA,也适于样本量较少的组织构建cDNA文库。坦引缩瘦体亭咙募塞频罐既钥现埃玄勉假熏拍俭拥孔笺肤袖唾铅账猜穿柔cDNA测序和表达谱研究cDNA测序和表达谱研究