文档介绍：BD流式基础知识-qj
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流式细胞术？
对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测
Flow Cyto metry
in motion
cell
measure
内物质浓度。
荧光信号（ Fluoresent light ）
荧光信号收集方向与激光束相垂直（90°）
Fluorescence
FALS Sensor
Fluorescence detector
( FL1,FL2,FL3,FL4)
接收光学系统
接收光学系统：接收光信号,并将光信号引导到对应的接收器中
光学滤片
460 500 540
460 500 540
460 500 540
SP 500
LP 500
BP500/50
Longpass Shortpass Bandpass
( 500+/- 25 )
FACSCalibur光路图
每个探测器前往往为BP，所以每个探测器只能接收特定波长范围的光信号
FL1:
515nm - 545nm
光学探测器
光电二极管 ---FSC Photodiodes
光电倍增管 --- SSC & Fluoresence Photomultiplier tubes (PMTs)
光电转换器：
将光信号转换为电信号
流式细胞仪的构造
3. 光信号转换成电信号，数字化处理
1. 细胞样本成单列依次通过光检测区
2. 激发并收集各种光信号
液流系统
光学系统
电子系统
电子系统
将光信号转化为电信号（模拟信号）
将模拟信号转化为数字信号
计算每个脉冲峰
和计算机连接以传出数据
将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机
光信号转换为电信号
Linear
Amplification
Log
Amplification
or
Voltage
Time
Voltage
PMT电压电信号
电压脉冲的产生—模拟信号
Laser
Laser
Laser
Time
Voltage
Time
Voltage
Time
Voltage
1
当微粒通过激光束时，脉冲开始。此时，激光强度和信号强度都很低。
2
当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。
3
当微粒离开激光束时，脉冲减弱。
计算一个电压脉冲峰
Time
Volts
Pulse Area
Pulse Height
Pulse Width
0
面积是对荧光光通量进行积分测量的结果
宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比
特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析）
模拟信号转换为数字信号
流式细胞仪的构造
3. 光信号转换成电信号，数字化处理
4. 数字信号传入计算机
1. 细胞样本成单列依次通过光检测区
2. 激发并收集各种光信号
液流系统
光学系统
电子系统
计算机系统
数据的获取表现
专业软件中的数据表现
单参数直方图双参数散点图三维点图
等高图密度图
设门（Gating）
平均荧光强度
百分比
流式细胞仪的构造
1. 细胞样本成单列依次通过光检测区
2. 激发并收集各种光信号
3. 光信号转换成电信号，数字化处理
4. 数字信号传入计算机
液流系统
光学系统
电子系统
计算机系统
分选系统
5. 活细胞分选
分选系统
检测
加电
偏转
收集
Review
Sorting
Review Questions
在仪器设置中调高 Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？
如何进行流式细胞实验？
1. 样本处理
2. 荧光染料的选择
3. 染色
4. 数据收集和分析
1. 样本处理
单细胞悬液
细胞悬液：
直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小
灌洗液、体腔积液
培养细胞、细胞系
实体组织：
病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本
针吸组织：新鲜样本
2. 选择合适的荧光染料
★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发
★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内
★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体
★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少
荧光信号（ Fluoresent light ）
Fluorescein (FI