文档介绍：白藜芦醇对宫颈癌Hela细胞VEGF表达和增殖的影响
【摘要】目的探讨白藜芦醇在体外对宫颈癌Hela细胞VEGF表达的影响。方法 MTT法检测不同浓度( 0、、25、50、100、200、300、400、600 μmol/L) Res处理24、48、72h对HeLa细胞的抑制率;RT-PCR方法检测VEGFmRNA表达水平,ethods Proliferation inhibitory effect RNA easured semi-quantitatively by RT-PCR, and the protEin level e-depend effects; The level of VEGF an cervical cancer Hela cell line in vitro.
【Key a公司。浓度为99%白藜芦醇粉末用二甲基亚砜(DMSO) 溶解,配成200 μmol/L的储备液,正压过滤除菌分装,4 ℃保存备用,实验前以培养液稀释成所需的不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT):武汉博士德公司产品,用天平称取MTT g溶于50 mL PBS浓度为 5 mg / mL在搅拌机上搅拌30分钟,过滤除菌,分装,4 ℃保存。DMSO购自美国Neentas公司,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。VEGF小鼠单克隆抗体为Santa cruz公司产品,SP 试剂盒及DAB试剂均购自北京中杉试剂有限公司。
细胞培养人宫颈癌Hela细胞株购自中科院上海细胞所,采用培养于含的RPMI1640培养液培养(内含10%小牛血清,青霉素100 U/mL,链霉素100 μg/mL)。培养条件为5% CO2, 37 ℃。
MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的作用将细胞以密度1×104/孔接种于96孔培养板中培养,培养12小时后,加入不同浓度的白藜芦醇(0、、25、50、100、200、300、400、600 μmol/L)继续培养。细胞培养24、48、72 h后加入MTT(5mg/mL)继续培养4 h,加入100 μL DMSO,震荡10 min。酶标仪上波长490 nm测定OD值。细胞生长抑制率( IR):IR(%) =( 1-试验孔A均值/对照孔均值) ×100% 。IC50值由NDST软件计算。每组设三个复孔,重复三次。
半定量RT-PCR检测 VEGFmRNA的表达分别设计与合成VEGF引物:上游:5′-AGCAGAAAGAGGAAAGAGG-3′,下游:5′-CCAAAAGCAGGTCACTCACTTTG-3′(产物长度133 bp);β-actin引物:上游5′-A-3′,下游5′-TTAATGTCACGCACG ATTT-3′(产物长度537 bp)。用TRIzol试剂提取细胞总RNA,按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA,然后进行CDl47和β-actin同管扩增。PCR体系为25 μL,反应条件:94 ℃预变4 min,94 ℃变性50 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延长50 s,共36个循环,最后72 ℃延伸10 min。 mmol/L溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝泳30 min,电泳后用凝胶分析扫描系统中测定各产物的吸光度(A)值,所有扩增A峰值均以
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