文档介绍：分子生物学综合实验实验报告
本次试验报告分为三个部分:
第一:每个基本实验的目的,原理,材料,试剂与仪器。
第二:以GFP质粒,P38质粒,植物DNA和植物RNA为材料的四个综合试验的实验过程。
第三:试验总结。
第一部分:每个基本实验的目的,原理,材料、试剂与仪器:
质粒DNA的提取
一、目的
学****碱裂解法提取质粒的原理
二、原理
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。目前,经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有:碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理:利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH=,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料、试剂与主要仪器
(一)实验材料
含质粒的大肠杆菌DH5α
(二)试剂
1. LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,溶解于1000mL蒸馏水中,。高压灭菌20分钟。
2. LB平板培养基:在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂,高压灭菌20分钟。
3. 溶液Ⅰ:50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH )。
Ⅱ: NaOH,1% SDS。(必须新鲜配制)
Ⅲ:(5mo1/L乙酸钾 60 ml, ml,水 )。
6. TE缓冲液(pH ):10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。
7. 无水乙醇和70%乙醇。
(三)仪器
1. Eppendorf管、离心管架
2. 10,100,1000 μl微量加样器
3. 台式高速离心机
4. 摇床、高压灭菌锅
琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

学****琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度,DNA的构型,含量以及分子量的大小。

琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法,它简单易行,只需少量的DNA就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物;使得DNA发射的荧光,增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照,就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照,只需5~10ng DNA,就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察,~。
在凝胶电泳中,DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应,前者由分子所带净电荷的多少而定,后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动,在用电泳法检测DNA分子时,应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定,提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压,也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
当然也可以用同样的方法检测RNA。
三、试剂与主要仪器
(一)试剂
1. DNA样品
2. TBE缓冲液(5×):用时需稀释10倍(配制见附录)
3. 点样缓冲液Loading buffer(10×):%溴酚蓝,40%甘油
4. 溴乙啶(EB):10mg/ml溴乙啶(注意:该试剂具致癌作用,用时要小心)
5. 琼脂糖
(二)仪器
1. 电泳仪系统
2. 紫外灯
3. 恒温水浴箱
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
一、目的
学****质粒的酶切及电泳分析。
二、原理
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点,并产生特异的切割,形成粘性末端或平末端,这样有利于DN***段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点,酶切后就能产生多少个片段