文档介绍：Prepared on 22 November 2020
质粒DNA提取实验
质粒DNA提取实验
质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实 Prepared on 22 November 2020
质粒DNA提取实验
质粒DNA提取实验
质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒DNA的纯化
一、材料与试剂准备
：大肠杆菌。
：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
：
（1）SolutionI：25mMTris-Hcl，10mMEDTA，50mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）SolutionII：，1%SDS现配现用。
（3）SolutionIII：，高压灭菌，4℃保存。
（4），高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、实验步骤

1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。
2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3）灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4）挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5）37℃，180rpm，振荡培养过夜。

1）离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入离心管中。
2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3）细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5）加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
6）加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。
7）室温，1500rpm，高速离心15min。
8）将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。
9）弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ulWB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。
10）重复上一操作。
11）将吸附柱放入干净的离心管中，加30-50ul预热的ElutionBuffer，室温，放置2min，高速离心1min。
12）样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。

1）将之前提取好的质粒放入离心管中，加入1/10体积的3mol/L无菌乙酸钠溶液。
2）加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6