文档介绍：实 验 五
动物肝脏中DNA的制备和鉴定
学时：6
1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3、学习核酸染色的方法。
一、实验目的：
二、实验原理:
要获得分离的关系     不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA.
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/%                                线状DNA大小/kb   60-5  20-1  10-  7-   6-  3-   2- 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。 （2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色后，在紫外灯(λ305nm)下观察到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。
激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收260nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。
2、优点：
（1）染色比较简便、快捷，一般在10－15min就可反应。
（2）EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做
到的。
（3）EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。
（4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。
（5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外
灯检测电泳的进程和效果。
（6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍，
因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。
3、缺点：
溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。
（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
（2）室温下放置1小时，不时的摇动；
（3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。
*溴化乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。
(一)材料：动物肝脏
(二)试剂：
（1）／LNaCl－／L EDTA-Na溶液：
（2）20％SDS溶液：
（3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液：
（4）95％乙醇溶液。
（5）80％乙醇溶液。
（6） 缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。
二、实验材料、试剂和仪器:
（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）。
（8）加样缓冲液：%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。
（9）溴化乙啶（EB）溶液：10μg/ml。
（10）琼脂糖凝胶：%。
(三)仪器
（1）稳压稳流电泳仪 （2）可调微量移液器
（3）水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。
移液器的使用
自动取液器的构造
自动取液器的使用
吸入液体
排出液体
使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。
三、实验步骤：
1．取新鲜动物肝，称取1g，切成小块，加入2ml ／L NaCl－／L EDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加2ml清洗转入离心管中，以4000r／min的转速离心 10min。
2．在上述沉淀物中加入2mLmol／L NaCl－