812-第三节 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）.ppt

文档介绍：第三节聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)
PCR是模拟体内DNA复制条件,应用DNA聚合酶反应,特异性扩增某一DNA片段的技术。
体外程序化的DNA合成技术。
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PCR
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原理:
1)合成待扩增区域两端已知序列,与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物,引物的序列决定扩增片段的长度;
2)反应体系:DNA模板,dNTP,Taq DNA聚合酶,buffer
3)反应程序: 变性94~95oC

复性延伸
37~55 oC 70~72 oC
72 oC延伸10min
DNA扩增100万倍
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PCR扩增
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PCR特点及应用:
特点:(1)特异性强,灵敏度高,稳定可靠,快
速;
2)微量的模板DNA即可扩增大量产物;
应用:(1)基因组DNA分析;
(2)遗传物质的鉴定;
(3)遗传病的诊断;
缺点:(1)需靶DNA序列的信息;
(2)产物短小,DNA复制不精确。
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PCR相关技术:
(booster PCR)
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题:一是形成引物二聚体,一是非特异扩增,消耗了引物和酶,而特异扩增片段产量降低。对于这种情况,可设置二步PCR,先用较低浓度的引物进行初级PCR,此时由于引物少,形成引物二聚体的可能减少,但它并不影响靶序列的扩增,只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充产物量,以初级PCR产物为模板进行扩增,靶序列的产量将相应增加。
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2. 巢式PCR(nest PCR)
此时也是进行二步PCR,与上面不同的是,第二级PCR需另行设置反应体系,并应用另外的PCR引物,此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧,用初级PCR产物做模板,进行第二步PCR,这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。
除了达到增效PCR同样的目的外,还提高了最终产物的特异性。
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在同一PCR体系中加入数对PCR引物,如果这些引物的退火温度相近,并且所覆盖的区域不重叠,这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。
多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失,或在检测缺失设置内对照。
3、多重PCR
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-PCR
RT-PCR是以mRNA为模板,经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA(pg水平)迅速扩增(达ng~ug水平),大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。
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RT-PCR
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