文档介绍：
G418的用途及配制方法
G418：白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CASNo.：
分子式：C20H40N4O10?2/ml）
中国仓鼠卵巢细胞
700～
800
Madin-Darby犬肾细胞
500
人上皮A431细胞
400
猿CV-1细胞
500
盘基网柄菌属
10～
35
植物
10
酵母
125～
500
加药时间
因为基因转染到细胞内以后要一段时间才能表达出蛋白质。因此挑选不可以太早；但是也不可以
太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入
的细胞所淹没，最后以致挑选不出阳性克隆，一般要在转染24小时以后才开始加G418挑选。随
着细胞的代谢G418的浓度和活性都会降落，因此每3~5天都要更换一次含有G418的挑选液。这
时药物浓度可以降至200ug/ml。
培育液
加药挑选约6天左右，细胞会大批死亡，孔中只剩下的细胞屈指可数。这时会出现两个问题：
，以致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。
，细胞之间的信号会变得很弱，也会以致阳性细胞的状态不好甚至死亡。这
个时候需要一种特别的培育液：若是你要转染3T3细胞，在3T3细胞会合度达到80%的时候，换
液，培育过夜以后采集培育液，经过滤器消毒，和新鲜的培育液按1：1混杂备用。再转染后筛
选过程中就可以应用这类培育基。
优选单克隆的优化
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增添阳性克隆的得率，可以应
用套环法或刮除法联合有限稀释法来挑选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆
很简单辨识，在阳性克隆下用记号笔做个标志。而后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后连续挑选培
养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到别的一个新的
2

孔中培育。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中挑选。
判定以后
一般经过4周左右的挑选，获取的阳性克隆都比较稳固。但是外源基因假如没有整合到基因
组中的话，目的基因还是很简单扔掉的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，并且是随
机整合，会以致表达的目的蛋白的量产生很大差异。跟着培育时间的连续，那些扔掉了外源基因
的细胞和极少表达目的基因的细胞会据有优势，强表达目的蛋白的细胞会愈来愈少。这样再次筛
选是必不行少的。只有经过2次以上的挑选以后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗
传稳固的细胞克隆。
的配制：取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
：取待测培育细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培育板中，培育6小