文档介绍：现代分析仪器应用技术
— 高效液相色谱仪
主讲：李春萍
西北农林科技大学生命科学学院
内容
色谱法基本知识
高效液相色谱相关内容
影响分离的因素
实验前准备工作
主要分析步骤
一、色谱分析法
起源
基本概念
分类提供150-450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
过滤器
梯度洗脱装置 : 可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。
高压输液系统
泵的保养
使用流动相尽量要清洁；
进液处的砂芯过滤头要经常清洗；
流动相交换时要防止沉淀；
避免泵内堵塞或有气泡。
进样系统
注射器进样
高压定量进样阀
泵
排放
进样
柱
泵
柱
进样
排放
5 高效液相色谱仪部件
进样方式与用量
六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，并且要求每次进样体积准确、相同；
使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。
六通阀使用和维护注意事项：
样品溶液进样前必须用滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。
转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。
为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。
分离系统
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。
一般备有一个前置柱（预柱）。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。
发展趋势是: 减小填料粒度和柱径以提高柱效。
柱子形状
色谱柱一般长5～30cm，内径4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。
5cm
10cm
15cm
40cm
色谱柱的保养
▲对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出范围(eg：C18柱pH范围是2-8)，温度不宜过高。
▲不能强烈震动，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙。
▲ 阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使固定相层位移，柱效下降。
▲ 进样样品要提纯并严格控制进样量；
▲ 在酸或碱性条件下使用后，应依次用水和甲醇清洗。
▲ 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的 溶剂来清洗色谱柱；
▲ 若长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。
检测系统
紫外检测器
光电二极管阵列检测器
示差折光检测器
荧光检测器
蒸发光散射检测器
紫外检测器（UVD）
特点：应用最广，对大部分的有机化合物有响应；灵敏度高；线性范围广；波长可选；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。
分析前，色谱柱平衡差不多时，打开检测器；分析完成后，马上关闭检测器。
光电二极管阵列检测器(PDA)
由1024个二极管阵列组成，可检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
时间
波长
吸光度
示差折光检测器（RID）
是通用型检测器（因为每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。
类型 ：
偏转式
反射式
干涉型
荧光检测器（FD）
高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B、 ***、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
蒸发光散射检测器（ELSD）
又称蒸发型质量检测器，属于通用型质量检测器。其工作原理：样品组分从色谱柱后流出，进入检测器后，经历雾化、流动相蒸发和（光源光路）检测三个步骤。
流动相
雾化气体
雾化
蒸发
检测
蒸发器
雾化器
光源光路
Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of droplets
Step 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remain