文档介绍：实验七
SDS-PAGE测定蛋白质的分子量
实验目的目的
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理
掌握垂直板电泳的操作方法
实验原理
带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下,移动的速度是 Vq
V= d6πrη
在同一电场强度(v/d)和电极缓冲液(η)条件下,带电的各种蛋白质成分,移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时,则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
实验原理
1967年shapiro等人发现在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸纳(sodium dodecylsulfate,SDS),不影响凝胶的形成,而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS之所以能获得这种效应,是因为SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键,使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS相结合,形成SDS-蛋白质复合物。
实验原理
其结果:(1)由于SDS解离后带有很强的负电荷,致使SDS-蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷,其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS与蛋白质结合后,改变了蛋白质原有构象,使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS-蛋白质复合物的短轴直径都一样,约为18 nm,而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。这样SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率,就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了,而只取决于椭圆柱长度,即蛋白质分子的大小。
实验原理
需要注意的是:为使SDS与蛋白质能充分的按比例结合,必须将蛋白质间的二硫键完全打开。因此,在用SDS处理蛋白质样品时,必须同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一种还原剂,它能使二硫键还原打开,并在有多余的巯基乙醇存在时,就不会再氧化为二硫键。
蛋白质与SDS结合后的复合物都是易溶的,因而有利于电泳。为满足SDS定量地与蛋白质结合,这种聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶及电极缓冲体系中都含有SDS,所以称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实验原理
1969年Weber和Osborn用此法测定了约40种蛋白质的迁移率,结果发现,蛋白质的迁移率与其分了量的对数呈直线关系:
Mw=K(10-bm)
lgMw=lgK-bm
lgMw=K1-bm
Mw=分子量,m=迁移率,b=斜率,K,K1=常数
用此法可以测得蛋白质的分子量。实验证明,分子量在12 000~200 000之间的蛋白质,用此法测得的分了量,与其它方法测得的相比,误差一般在±10%以内,重复性高。
实验原理
应用此法测定分子量时,首先将几种已知分子量的标准蛋白质混合物,与被测蛋白质同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后测出各个蛋白质成分的迁移率,再以标准蛋白质分子量的的对数为纵坐标,迁移率为横坐标,绘出一条直线型的标准曲线。
被测蛋白质的分子量只要测得迁移率即可从标准曲线上求出。
如下图所示:
几种已知分子量的标准蛋白质
被测蛋白质
实验原理
Weber的实验指出,不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。如15%的凝胶适用于分子量在10000~50000范围的蛋白质;10%的凝胶适用于分子量在10000~70000范围的蛋白质;5%的凝胶适用于分子量25000~2000000范围的蛋白质;%的凝胶其胶孔径更大,适用于分予量更高的蛋白质的测定。使用时应根据待测蛋白质样品的分子量范围选择合适的凝胶浓度,以求获得好的结果。