文档介绍：蛋白质免疫印迹技术及
常见问题分析
Western Blot简介
Western Blot一般流程
Western Blot常见问题分析
Western Blot 简介:
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western Blot 基本原理:
首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离,然后转移到固相载体(例如NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的NC膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液(如5%的BSA或脱脂奶粉溶液)处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点,而后用所要研究的蛋白质的抗体(一抗)处理,印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,而其它的蛋白质不能与一抗结合,这样清洗除去未结合的一抗后,印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
Western Blotting方法
直接法:
优点:
(一种抗体)
缺点:
,使用不方便
间接法:
优点:
,灵敏度高(多个二抗结合位点)
缺点:
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是从鼠中获得的,则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。
目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗,最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处理后,再用适当的底物溶液处理,当酶催化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足,标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗,避免了标记很多一抗的需要,同时因为一抗结合不止一个二抗分子,所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
Western Blot 优点:结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点
高分辨率的电泳技术
特异敏感的抗原-抗体反应
1-5ng (最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白
Western Blot应用
目的蛋白的表达特性分析
目的蛋白与其它蛋白的互作
目的蛋白的组织定位
目的蛋白的表达量分析
Western Blot 被广泛地应用于蛋白质研究,基础医学和临床医学的研究。