文档介绍：重庆大学硕士学位论文中文摘要
摘要
化合物活性筛选是药物创新研究的起点和具有决定意义的步骤,是源头创新
和持续创新的关键,离开筛选就无从发现具有某种特定生物活性的新型化学物
质,新药的研究开发就将成为无源之水。但是,这种基本技术能力恰恰是我国创
新药物研制中最为突出的薄弱环节,成为制约医药工业转型的"瓶颈"之一。传统
的动物筛选模式劳动强度大、效率低,近年来,随着分子生物学、分子药理学和
自动化技术的发展,高通量药物筛选(High throughput screening, HTS)成为药物早
期发现的重要手段。它是利用药靶的分子或细胞水平的生物学机制,以微孔板为
基础进行大量筛选,找到能选择性作用于药靶的活性化合物,具有微量、快速、
灵敏、准确等优点。
人胰高血糖 Glucagon Receptor (GCG-R)能够活化腺苷酸环化酶,通过 Gs 型
蛋白偶联 GTP 使细胞内信号完成表达。胰高血糖素具有活化磷脂酶 C,并通过肌
醇磷酸盐通道导致细胞内 Ca2+流失,升高血糖的生理学功能, GCG-R 偶联 Ca2+
流失,经 Gs 通道激活腺苷酸环化酶激活了其信号转道通路。GCG-R 的拮抗剂可
能是治疗 2 型糖尿病的有效药物。为了进一步了解 GCG-R 的生理学功能和开展
抗 2 型糖尿病新药研究,作者建立了 GCG-R 拮抗剂的高通量筛选模型,并以天
然产物为资源,筛选了 GCG-R 的拮抗剂。
建立了人 GCG-R 基因质粒(GCG-R/ )和一个能同时响应 Gs、Gi 和
Gq 受体的报告基因质粒(MRE/CRE/SRE/LUC),并将 GCG-R 质粒和报告基因质
粒共转染到 HEK293 细胞、SH 细胞、CHO 细胞、Hela 细胞等,通过 G418 筛
选,建立了稳定的 GCG-R 受体拮抗剂筛选细胞株,并选出最优的 CHO 细胞株作
为筛选用细胞株。当化合物与膜表面的 GCG-R 结合后,抑制 GCG-R 对应的信号
级联反应,改变胞内第二信使的表达水平,响应元件响应这种变化,促进报告基
因的表达。通过检测细胞质中报告基因的表达量,间接评估化合物的生物活性。
为了有效排除筛选过程中的假阳性和假阴性,同时建立了只含报告基因质粒
的阴性细胞株。
利用 cAMP 响应元件 CRE 的激活剂 Forskolin 和受体内源激动剂 Glucagon 探
索和优化了荧光素酶表达时间、每孔细胞数目、溶剂 DMSO 终浓度、荧光素酶底
物浓度等筛选实验条件,建立了可靠的筛选方法。实验结果表明,GCG-R 细胞株
用于高通量筛选的条件为:细胞数目 4104 个/孔,激动剂孵育时间为 6h,每孔
DMSO 终浓度小于 1%,荧光素酶底物终浓度为 %(V%),其系统 Z’因子为
,适用于 GCG-R 拮抗剂的高通量筛选。
I
重庆大学硕士学位论文中文摘要
利用建立的筛选模型对 500 种天然产物水醇提物 10500 个样品进行了筛选,
发现 43 种天然产物水提物样品对 GCG-R 活性有较好的抑制作用。
综上所述,本文建立的筛选模型能够用于 GCG-R 拮抗剂的高通量筛选。
关键词:GCG-R,高通量药物筛选,报告基因,天然产物
II
重庆大学硕士学位论文英文摘要
ABSTRACT
Screening pound is the beginning and a vital step in innovative drug
research. Without screening, novel chemical substances with specific biological
activities cannot be discovered and new drug research will be impossible. However,
such a basic technical capability is one of the ponents in China's innovative
drug research initiative and a "bottle-neck" in the transformation of its pharmaceutical
industry. Animal screening is the traditional screening method with hard work and low
efficiency. Recently with the development of molecular biology, molecu