文档介绍：乙酰化修饰定量蛋白质组学
主要内容
乙酰化修饰非标定量技术简介
乙酰化修饰非标定量技术原理
乙酰化修饰非标定量技术优势
乙酰化修饰实验流程
乙酰化修饰实验结果示例
乙酰化修饰实验详细步骤
经典案例
乙酰化修饰非标定量技术简介
蛋白质的乙酰化修饰是在乙酰基转移酶的作用下,蛋白质的赖氨酸残基上添加乙酰基的过程,是细胞控制基因表达、蛋白质的活性或生理过程的一种机制。
最近的调查表明,蛋白质的赖氨酸残基的乙酰化普遍存在于人体的代谢酶之中,具有调节代谢通路及代谢酶的活性。乙酰化是一个普遍和重要的蛋白质翻译后修饰,主要集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面 ,还影响参与细胞周期和新陈代谢、肌动蛋白聚合控制,蛋白的乙酰化状态调节受损的癌症和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性,与肿瘤等等疾病密切相关,也是目前正在开发的抗癌药物的靶点。通过高通量的蛋白质组研究和不同物种的代谢通路研究发现,在生理状况下,存在着大量非细胞核的蛋白质被乙酰化修饰,具有广泛的生物学意义。
乙酰化修饰非标定量技术原理
技术原理
赖氨酸发生乙酰化的蛋白对各种生物功能进行调控。实验基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体,对含有乙酰化修饰的赖氨酸肽段进行富集。乙酰化之后的肽段,质量发生42Da 的质量变化,基于非标定量的质谱方法对乙酰化肽段进行鉴定。
如:组蛋白乙酰化多发生在核心组蛋白N一端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基,将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的sNH3+中和掉1个正电荷。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltmnsferse,HATs)和组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase,HDACs)共同决定。在细胞核内,组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡,精确地调控基因的转录和表达。
乙酰化修饰非标定量技术优势
乙酰化抗体:特异性识别乙酰化赖氨酸残基;精准锁定目标范围。
灵敏度高:可检测出低丰度蛋白;
分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白,小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等;
适用范围广:可以对任何类型的蛋白质乙酰化进行鉴定,包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。
高通量:不受样本数据限制,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析;
结果可靠:定性与定量同步进行,同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息;
自动化程度高:液质联用,自动化操作,分析速度快,分离效果好。
乙酰化修饰实验流程
乙酰化修饰实验流程。
1:收集不同组别的样本并分别提取蛋白质;
2:蛋白质经过还原,封闭后用胰蛋白酶酶切;
3:各组样本肽段进行纯化;
4:各组样本的肽段分别用乙酰化抗体试剂进行富集,并RP分离馏分;
5: Q-Exactive 质谱检测,定性及定量分析;
6:流程化生物信息分析及个性化设计生物信息服务
蛋白质样品制备
样品及实验预判
酶解
乙酰化抗体富集
RP分解
质谱分析
软件分析
定性定量蛋白质组学结果
统计学、生物信息分析
乙酰化修饰实验结果示例
小鼠的肌肉样本:乙酰化修饰实验(4例样本:A、B、C、D)
1: 提取各组蛋白质,定量并用胰酶酶切;
2. 各组肽段纯化,并用乙酰化修饰抗体进行富集;
3. RP分离和质谱分析.
4: 不同样本中乙酰化修饰的差异表达可通过二级质谱中峰面积确定
5. 根据该肽段的二级质谱峰图,结合数据库检索,得到蛋白的定性及定量信息。
质谱扫描完毕,得到质谱信号总图
横坐标是洗脱时间,纵坐标是信号强度。
乙酰化修饰实验结果示例
4例样本共鉴定到1449个蛋白,肽段6879个,乙酰化修饰肽段637个。乙酰化修饰的差异分析如下:
两两比较
显著差异
B/A
189
C/B
202
D/C
248
C/A
243
D/A
273
鉴定到的蛋白列表-结果
鉴定到的肽段列表-结果