文档介绍：质粒DNA提取 (碱裂解法)
实验目的
实验原理
实验仪器、材料与试剂
实验步骤
实验结果及讨论
实验目的
了解碱裂解法提取质粒的原理;
掌握碱裂解法提取质粒的方法。
实验原理
质粒:是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。
碱裂解法提取质粒:是实验室常用的制备质粒的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
载体
基因工程中,携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体,主要有大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒等
作为基因工程用的载体必须具备以下条件:
起始复制子
有一个或多个利于检测的遗传表型
有一系列限制性内切酶的单一识别位点(多克隆位点)
适当的拷贝数
基本结构的三大要素:
多克隆位点
选择标记(耐药性,LacZ)
独立的复制子
种类:
质粒
噬菌体
酵母人工染色体(YAC)
反转录病毒载体
表达载体等
质粒
质粒是基因工程中常用的载体之一,是染色体外小型双链环状DNA,大小在1~200kb之间,存在于细菌、放线菌、真菌以及一些植物细胞中,在细菌中最多。
T-载体
在碱性条件(pH )下,细菌的线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕,紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时,染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA分子很快复性,离心时染色体DNA、细菌碎片、蛋白-SDS一起被沉淀下来,而质粒DNA则留在上清液中。
RNA通过胰RNA酶A水解
用乙醇沉淀并洗涤,可得到较纯的质粒DNA。
碱裂解法原理