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2021年1月胁一d吼n质一谱№学妈p报咖㈣my‰
基于UPLC—Q/TOFMS及网络药理学的
丹参川芎嗪注射液抗血瘀活性成分和机制研究
董庆海1,刘慧2,刘俊丽1,林红强1,焦玉凤1,司雨1,
刘云鹤1,王钟瑶1,刘金平1,李平亚1,李卓1
(,吉林I=乏春13002l;
,吉林梅河几135000)
摘要:运用网络药理学方法研究丹参川芎嗪注射液抗血瘀的活性成分及机制,采用UPI。CQ/I、OFMS
技术测定其化学成分,、保留时间及质谱碎
片离子信息,并分析鉴定其结构。利用里宾斯基五规则筛选出全成分中的活性成分,运用TCMSP、
DisGeNET、DAVID等数据库预测活性成分的作用靶点、疾病靶点和生物通路,通过Cytoscape软件构
建活性成分、作用靶点、生物通路网络。本实验共鉴定出40个成分,经筛选得到20个活性成分,涉及51
个疾病靶点,作用于P13KAkt、MAPK等10条信号通路。该方法初步揭示了丹参川芎嗪注射液的药效
物质基础,可为阐明该注射液抗血瘀作用机制提供参考。
关键词:丹参川芎嗪注射液;活性成分;UPI,CQ/T()FMS;网络药理学;抗血瘀作用
中图分类号:0657文献标志码:A文章编号:1004—2997(2021)01—0024—12
doi:】.0】30开放科学(资源服务)标识码(OSlD):
StudyonAnti—BloodActiveIngredientsandMechanism
ofDanshenLigustrazineInjectionBasedOilUPLC—Q/TOFMSand
NetworkPharmacology
DONGQinghail,LIUhui2,IAUJunlil,LIHongqian91,JIA()Yufen91,SIYu
I。IUYunhel,WANGZhongya01,IAUJinpin91,LIPingyal,LIZhu01
((hCenter,Collegeu厂Pharmacy,
JilinUniversily。Chang(hunl3002l。China:
’ha,gPItarDz“(’eutic“ZCo.,Ltd.,NIeihekou135000,China)
Abstract:
miltiorrhizaandIJgustrazineinjection,andthecomponentswerecomparedbyUNIFI
收稿日期:20100927;修回日期:20l91206
基金项目:吉林省省校共建计划专项(SXGI。SF2017l1);吉林省科技发展计划项目(20180004)资助
作者简介:董庆海(1994),男(汉族),河北人,硕士研究生,天然药物化学专、lk。Email:******@
通信作者:李申(1086),女(汉族),吉林长春人,障士后,从事天然药物化学成分及其生物学活性研究。
万方数据Email:******@:.
molecularnlass,retentlonnmc,andnla5s
ioninformationwereusedtoanalyzeandidentifystructures·Varloustypesot
fragment
c。m_poundssuchasflayonoids,esters,andquinoneswereidentifiedintheinjectionw1‘h
atotalofm。
rhiza,Drotocatcchuicacid,caffeicacid,salvianolicacidandotherwater—solublccompo—
nentsofsalviamihiorrhizaeandligustrazine,alandmarkcomponentofchuanxiongalka
—oxidation,anti—plateletactlVatlon,Pr。tec—
tiondamagetovascularendothelialceils,protectionofischemiccardiomyocytes,Pr。tec
tionofinjuryofbraincells,liverprotection-kidneyandnlanYo‘h—
ischcmia—reperfusion
Dhatmacological
Dromoteblo。,the1dcn“ilcd
c。mDoundswerescreenedusingtheFiveRibskyrule,andthechemicalcomp。nents
screenedwereclassifiedasactiveingredientsthatmightenterthebodytOplay8role.
DatabasessuchasTCMSP,BATMANTCM,SwissTargetPrediction,DisGeNET,
targetsf。rblo。dstasisdiseases,andscreenfortargetswherethetwomtersect·Atotal
of20activewerescreened,involving51intersectiontargets·上heactlVe
ingredients
antibloodstasistargetnetworkmapwasconstructedbyCytoscapes。ttware·
ingredient
UsingDAVIDandotherdatabasestopredicttheanti—bloodstasispathwaysofInt。。8。。一
tiontargets,atotal。f24targetsincludingAKTl,MAPKl,PIK3CG,REI—A,and
BCI。2wereDredictedtobeinvolvedintheP13K—Aktsignalingpathway,plat。l。tactlva-
tionpathway,sphingolipidsignalingpathway,cAMP10pathwaysincluding819nal
Dathwav,mTORsignalpathway,VEGFsignalpathway,MAPKsignalpathw8y·
AMPKpathway,JAKSTATsignalpathway,arachidonicacidmetabolismw。。8
signal
relatedtobloodstasisdiseases,andanti—bloodstasistargetswereconstructedbYLYto—
scaDes。。wed
thatSalviamihiorrhizaandLigustrazineinjectionwererichinsmall—molecule。h。m1。8l
c。—bloodstasls
networkdiagramandanti—bloodstasistarget—actionpathwaynetw。rkdlagranl
target
c。”mul‘卜
thetreatmentofbloodstaslsdlseaseproVldesa
comDonent—muhi—target—multi—path”in
theoreticalbasisforfurtherresearchonthebasisofmedicinalsubstancesandmechanism
ofaction.
Kevwords:Danshenligustrazineinjection;activeingredient;UPI—CQ/TOFMS;net—
workDharmacology;anti—bloodstasis
丹参川芎嗪注射液具有抗血小板聚集、清化学成分的分析。因此,有必要进一步研究丹
除氧自由基、改善微循环、改善脑循环的作参川芎嗪注射液的化学成分,进而明确其药效
用Ⅲ,临床上用于治疗闭塞性脑血管疾病及缺物质基础,建立科学的质量控制方法。
血性心血管疾病:…。药物的化学成分是其发挥超高效液相色谱一四极杆飞行时间串联质
药理作用的物质基础。目前,关于丹参川芎嗪谱技术(UPI。C—Q/TOFMS)以超高效液相色
注射液化学成分的报道多集中于丹参酚酸的检谱作为色谱分离系统,将四极杆和飞行时问
万方数据
测及含量测定‘…,尚未见丹参川芎嗪注射液中质谱作为分析器口1,可精确测定分子质量,且:.
26质谱学报第42卷
灵敏度高、选择性好、分离准确、速度快。北京普天同创生物科技有限公司产品。
通过前期的药效学研究¨o发现,
嗪注射液能够明显改善急性血瘀模型大鼠血FAll04N型电子天平:上海民桥精密科学
液流变学指标,并通过下调血浆中GMP一140仪器有限公司产品;TGI。16aR型飞鸽超离速
蛋白、vwF因子含量治疗血瘀。但是,尚不明离心机:上海安亭科学仪器厂产品;RE52CS型
确注射液中哪些成分发挥了治疗作用。2008旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器有限公司产品;
年,Hopkins61提出网络药理学的概念,并将其N—A35型氮气发生器:青岛海科仪器有限公司
定义为运用网络方法分析药物、作用靶点和产品;XevoG2XS型QTOF质谱仪、ACQU
疾病之间“多成分多靶点多途径”、UNIFI科
的药理分支学科7。网络药理学认为,机体的学信息学系统:美国Waters公司产品。
健康是由复杂的动态生物网络来维持的,
态网络的失衡导致疾病的发生,。CBEH
些靶点处于功能失衡状态[8。在运用网络药C18色谱柱(100mill××,um);柱
理学研究某种药物治疗某种疾病的作用机制温30。C;样品管理器温度15℃;进样体积
时,以生物网络中的靶点为切入点,从整体网5扯I.;;流动相:%甲
络动态稳定角度分析药物中分子与网络中功酸水溶液,%甲酸乙腈溶液;梯度洗
能失衡靶点的关联及动态变化规律[9]。构建脱条件:0~2rain(10%B),2~26rain(10%~
化学成分靶点信号通路疾病全方位多层次90%B),26~28rain(90%B),28--29min(90%~
网络模型,可深刻揭示药物分子和动态生物10%B),29~30rain(10%B)。
网络的关系,(ESI),MS8
机制。1”J。continuum模式;质量扫描范围m/z100~
本实验拟采用网络药理学研究方法并结合1500;正、负离子检测模式;正、负离子模式下,
UPI。CQ/TOFMS技术,通过保留时间、,锥孔电
子离子质荷比及碎片离子,分析鉴定丹参川芎压均为40V,锥孔气流量50I./h,脱溶剂氮气
嗪注射液的化学成分,并据此研究该注射液治流量600L/h,。rain,离子源
疗血瘀的活性成分和作用机制。温度120℃,脱溶剂气温度300。C;低能通道碰撞
能量6V,高能通道碰撞能量20~40V;采用100
l实验部分ng/(EM+H3Or,/)、
[M—H3(tn/))作为LockSpray
丹参川芎嗪注射液(批号:20170211):吉林校正标准液,对仪器进行实时校正,其校正流速
四长制药有限公司产品;甲醇:分析纯,天津新为正离子模式15ffI。rain,使用甲酸钠溶液对
通精细化工有限公司产品;甲酸钠、乙腈:美国质量数进行校正。
Fisher公司产品;亮氨酸一脑啡肽:
公司产品;实验用水:屈臣氏纯净水,广州屈臣取1支丹参川I芎嗪注射液(5mI./支),于
氏食品饮料有限公司产品。80℃下减压旋干,并用80%甲醇复溶,置于
咖啡酸(批号:1**********)、迷迭香酸2mI。容量瓶,用80%甲醇稀释并定容。混合均
(批号:1**********)、盐酸川芎嗪(批号:匀后,于4℃下以10000r/rain离心10rain,
1**********)对照品:由中国食品药品检定吸取适量溶液于进样瓶中,备用。
研究院提供;原儿茶醛(批号:1**********)、
丹参素钠(批号:110855—200809)、丹参素钠(批采用UPI。CQ/TOFMS模式采集数据,
号:1**********)对照品:由中国药品生物制使用UNIFI软件进行丹参提取液化学成分的
品检定所提供;丹酚酸B(批号:150927)、原儿自动识别。第一步,查阅文献,建立丹参、川
茶酸(批号:171109)、丹酚酸A(批号:171217):万方数据芎嗪数据库以补充原有的传统中药库,将查:.
第l期董庆海等:基于UPI。CQ/TOFMS及网络药理学的丹参川芎嗪注射液抗血瘀活性成分和机制研究27
找到的化合物化学结构保存为mol格式文件,行二级质谱分析,得到特征碎片离子,再结合对
然后将丹参、川芎嗪数据库导入分析方法中;照品及相关文献,共鉴定出40个化学成分,包
第二步,将原始数据通过WatersCompression括黄酮类、酯类、醌类、醇类、苯酚类、萜类、芪
;第三类、酚酸类、有机酸类、糖类和吡嗪类化合物,其
步,UNIFI软件自动对数据筛查、鉴定,代替保留时间、分子式、准分子离子峰实测值及理论
传统的人工提峰、计算分子式以及分析碎片值、质量误差、主要碎片离子和来源等信息结果
断裂情况;第四步,建立一个过滤筛选方法,列于附表1,并对其结构进行归属,结果示于附
设定质量误差为±6×106,且响应值大于图1~5(因篇幅所限,附表、附图请登录“质谱
3000;最后,结合碎片离子理论精确质量学报”网站下载)。
数、保留时间和分子式,
及查阅相关文献,对各主要化合物进行人工定出4种黄酮类化合物。以化合物1为例,在
识别和鉴定。ESI模式下,,准分子离
、疾病靶点、作用通路网络图的子峰为171/+HC00],产生2
构建个主要碎片离子,碎片m/
对鉴定出的化合物进行筛选,将符合里宾子失去2个CH。、1个H:()得到的EMH
斯基五规则的化合物归类为活性成分。将活性2CH。一H:()],碎片DI/>:
成分输入到TCMSP(。H。O:得到的[MHGH。O:]~,
)、BATMAN—。结合文献
)、SwissTargetPredic报道[11I,推断化合物1为1一羟基一2,3,4,7一四甲
tion()氧基吨酮。
等数据库中收集活性成分的靶点,
分潜在作用靶点库。以血瘀相关疾病为关键词出12种酯类化合物。以化合物13为例,在
(如血栓、静脉血栓、动脉血栓、脑血栓、冠状动ESI模式下,,准分子离
脉血栓),在TTD(httP://,产生3个主
group/cjttd)、DisGeNET(,碎片DI/
)、GeneCards(https:∥—去1个HCOOH得到[MHHCOOH]~,
)等数据库中搜索已报道的疾病靶碎片m/
点,构建疾病靶标库。将活性成分潜在作用靶HCOOH、1个GH。(尢得到[M—HHCOOH
点库与血瘀疾病相关靶标库进行对比分析,筛C。H。()j],碎片m/
选出其中的交集靶。将活性成分和与之相应的1个HCOOH、1个C。H。Oj、1个C。HjO:得到
交集靶点导人Cytoscape软件,构建活性成分一[M~H—HCO()H—C。H。Oj~C6H5O:],其
抗血瘀靶点网络。将交集靶点输入DAVID高能质谱图和裂解碎片示于图3。结合文献报
()数据库中,进行道“。,推断化合物13为紫草酸。
KEGG通路富集分析,
病靶点一作用通路网络图。出7种酯类化合物。以化合物28为例,在
ESI一模式下,,准分子离
2结果与讨论子峰为m/[M+HCOO],产生2
,碎片m/
正、负离子模式下的质谱基峰离子流图示子失去1个H:O、1个CH。得到rMH
于图l。利用UNIFI数据处理系统和MassI。Hz()一CH。],碎片m/
。H,:得到[MHC。H。:],其高能
析。根据得到的精确分子质量,获得可能的元质谱图和裂解碎片示于图4。结合文献报
万方数据
素组成,确定可能的分子式。通过对各成分进道”,推断化合物28为柳杉酚。:.
28质谱学报第42卷
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;/min
∥min
图l丹参川芎嗪注射液在正(a)、负离子模式(b)下的基峰离子流(BPI)图
(BPI)ehromatograms
ofDanshenLigustrazineinjectionatpositive(a)andnegative(b)modes
,去除不适合成为药物的分子。通过
液中鉴定出12种有机酸及醇类化合物。以化TCMSP数据库,从40个化学成分中筛选出
合物2为例,在ESI模式下,,并将其
min,准分子离子峰为m/[M—归类为活性成分,结果列于表1。
HI,产生3个主要碎片离子,碎片Ⅲ/、血瘀疾病靶点库的构建
:()得到的[M—收集20种活性成分在TCMSP、BATMAN—
H—H。()],碎片m/、SwissTargetPrediction数据库中作用
1个H:()、1个HCOOH得到的[MHH:()的靶点,利用UniProt数据库将活性成分对应
一HCOOH],碎片m/(homosapiens)的标准基
失去C:H。()。得到的[MHC。H。O。],其因。将整理好的靶点汇总在一起,删除重复
高能质谱图和裂解碎片示于图5。这与丹参素项,共得226靶点,构建活性成分潜在作用靶
对照品的保留时间和碎片离子相吻合,推断化点库。从DisGeNET、TTD、GeneCards等数据
合物2为丹参素。库中搜索与血瘀疾病相关的靶点,将以上靶
,删除重复项,共得490个靶点,以此
里宾斯基五规则常被用于对化合物进行构建疾病相关靶点库。
万方数据:.
第1期董庆海等:基于UPI。cQ/TOFMS及网络药理学的丹参川芎嗪注射液抗血瘀活性成分和机制研究29
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图2ESI模式下,化合物1的高能质谱图
—energymassspectrumofcompoundlatESI—mode
图3ESI一模式下,化合物13的高能质谱图
—energymassspectrumofcompound13atESI—mode
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—芒5I
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120140160180200220240260280300320340
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图4ESI一模式下,化合物28的高能质谱图
—energymassspectrumofcompound28atESI—mode
,表明活性成分之间
活性成分一抗血瘀靶点网络共包括71个并不是单独发挥作用的,它们之问相互影
节点,122条边,其网络图示于图6,外周的响,共同发挥作用。此外,对活性成分抗血
黄色节点代表活性成分,中问的其他颜色节瘀靶点网络进行拓扑结构分析,以拓扑结构
点代表交集靶点,中间其他颜色节点与外周特征值“连接度”作为参考指标,选择连接度
黄色节点的连线代表活性成分与靶点之问大于2倍中位数的节点,在此基础上结合
的作用关系。可以看出,同一个活性成分可“接近中心性”和“中介中心度”对筛选出来
以作用于不同的靶点,而同一个靶点也可以万方数据的节点进行二次筛查,挑选三者值均靠前的:.
30质谱学报第42卷
靶点作为关键性节点。共筛选出前列腺素TH)、过氧化物酶体增殖物激活受体),(Peroxi—
G/H合成酶1(ProstaglandinG/Hsynthase1,SOITleproliferatoractivatedreceptorgamma,
PTGSl)、前列腺素(;/H合成酶一2(ProstaglandinPPARG)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3(Muscarinic
G/Hsynthase2,PTGS2)、p2肾上腺素能受体acetylcholinereceptorM3,CHRM3)等关键性节
(p一2adrenergicreceptor,ADRB2)、雌激素受体点,表明这些节点受多种活性成分的调节,推测
(Estrogenreceptor,ESRl)、凝血酶(Thrombin,其在注射液治疗血瘀中发挥了重要作用。
蚤
磊C磊C
尘
三
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图5ESI模式下,化合物2的高能质谱图
—energymassspectrumofcompound2atESI—mode
表l丹参川芎嗪注射液活性成分筛选结果
Table1ScreeningresultsofactiveingredientsofDanshenligustrazineinjection
化合物相对分子质量脂水分配系数氢供体氢受体可旋转数量
CompoundMwAlogPHdonHaccRBN
,
]
]
5,7,4’
丹参酮Ⅱ
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第】期董庆海等:基于UPI,CQ/"I、OFMS及网络药理学的丹参川芎嗪注射液抗血瘀活性成分和机制研究31
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DanshenolATetramethylpyrazine
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