文档介绍：实验二目的基因PCR扩增产物的克隆
[实验目的]
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[实验原理]
在高离子盐存在的情况下,DN***断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液,将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后用低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。
源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DN***断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5’除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DN***断的3’OH末端与5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与T -Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
[实验材料、试剂和仪器]
PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。
[实验步骤]
10×PCR Buffer
μl
dNTPs
μl
Taq
μl
引物1
μl
引物2
μl
ddH20
μl
DNA模板
μl
PCR反应体系: