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2021;38(8)1491
JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY··
杜仲黄***对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响*
△
范春惠1,张琳惠1,郑妮2
(,杭州310000;,深圳518000)
摘要目的:探讨杜仲黄***对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响。方法:链脲佐菌素联合高脂高糖饮食共同诱导构建糖尿病
小鼠模型。将40只糖尿病模型小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和杜仲黄***低、高剂量组,每组10只。另以10只健康昆明小
鼠为空白对照组。末次给药2h后检测各组空腹血糖(FBG)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清胰岛素(FNS)、总
抗氧化能力(T-AOC)含量,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,胰腺组织ATP酶、线粒体呼吸链ComplexI、Com-
plexIII活性及氧自由基(ROS)、ATP含量。Westernblotting法检测胰腺组织中核呼吸因子1(NRF1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)
蛋白表达量。结果:与模型组比较,杜仲黄***高、低剂量组小鼠FB***平显著下降,血清FNS、T-AOC含量及CAT、SOD活性增
Ⅲ
加(P<<);胰腺ATP含量增加,ROS含量减少,ATP酶、ComplexI、Complex活力增加(P<<);胰
腺中NRF1、Mfn1蛋白表达增加(P<<)。结论:杜仲黄***能改善胰腺组织线粒体功能,其作用机制可能为调节线
粒体生物合成因子和融合因子的表达,提高胰腺的抗氧化能力及线粒体的呼吸功能,保障能量的供应,使胰岛素分泌增加,达
到降血糖的作用。
关键词杜仲黄***;糖尿病;胰腺;线粒体
中图分类号:R259文献标志码:A文章编号:1005-930X(2021)08-1491-06
DOI:.45-1211/
EffectsofEucommiaflavonoidsonthefunctionofpancreaticmitochondriaindiabeticmice
FanChunhui1,ZhangLinhui1,ZhengNi2.('sHospitalAffiliatedtoZhejiangUniversitySchoolofMedi-
cine,Zhejiang310000,China;,Shenzheng518000,
China)
AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofeucommiaflavonoidsonthefunctionofpancreaticmitochon-
:Thediabeticmicemodelwereestablishedbytailveininjectionofstreptozotocin
(STZ)combinedwithhigh-fatandhigh-,
metformingroup,low-doseandhigh--
,thefastingbloodglucose(FBG)of
micefastedover2hoursweredetected,-
tentsofinsulin(FNS),totalantioxidantcapacity(T-AOC)andtheactivitiesofcatalase(CAT),superoxidedis-
mutase(SOD),mitochondrialrespiratorychainComplexI,IIIandoxy-
genfreeradicals(ROS),-
-
sults:Comparedwithmodelcontrol,theFBGwasdecreasedinmicetreatedwitheucommiaflavonoids,andthe
activitiesofCAT,SODandFNS,T-AOClevelswereincreased(P<).Inpancreastissues,activitiesof
ATPase,mitochondrialrespiratorychainComplexI,IIIandATPlevelswereenhanced,theROSlevelwasincon-
trast(P<<).Inaddition,theexpressionsofNRF1andMfn1wereup-regulated(P<).Conclu-
sion:Theunderlyingmechanismofeucommiaflavonoidsonimprovingpancreaticmitochondrialfunctionmaybe
associatedwiththemodulationonmitochondrialbiosynthesisfactorandmitochondrialfusionfactor,elevating
theanti-oxidantcapabilityofpancreasandthemitochondrialrespiratoryfunction,benefitingtheenergysupply
andinsulinsecretion,resultinginhypoglycemia.
*基金项目:国家自然科学基金资助项目()KeywordsEucommiaflavonoids;diabetesmelli-
△
通信作者,E-mail:******@;pancreas;mitochondria
收稿日期:2021-03-03
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··广西医科大学学报;()
线粒体是机体进行氧化磷酸化、氧化代谢的细Mini-ProteanTetra垂直电泳仪、转膜显影设备、Gel-
胞器,其为机体的生命活动合成机体必须的能量物DocEZ凝胶电泳成像分析系统(美国Bio-Rad公
质腺苷三磷酸(ATP),同时具有调控活性氧(ROS)司)。
依赖的胞内信号,[5]
用[1]。2型糖尿病(T2DM)是因胰岛组织生理或病理小鼠尾静脉注射STZ(25mg/kg)1次,高脂高糖
≥
缺陷而造成β细胞分泌胰岛素不足,造成血糖升饲料喂养8周后检测小鼠空腹血糖(FBG),FBG
高。研究发现,。将T2DM模型小
常、线粒体氧化酶活性和肌肉脂质代谢水平降低有鼠随机分为模型组、二甲双胍组、杜仲黄***低剂量
密切关系[2]。因此,寻找改善线粒体作用的药物对组、杜仲黄***高剂量组,每组10只。另以健康昆明
于T2DM的防治具有重要的意义。小鼠为空白对照组。二甲双胍组予32mg/kg二甲
杜仲黄***是从杜仲科植物杜仲(Eucommiaul-双胍混悬溶液,杜仲黄***高、低剂量组分别予160
moidesOliver)的干燥树皮中提取的主要成分。有mg/kg、80mg/kg杜仲黄***混悬溶液,各组灌胃予相
研究表明,杜仲黄***对糖尿病及糖尿病肾病小鼠均对应药物60d,1次/d。模型组和正常对照组小鼠灌
有良好的治疗作用[3-4],但其具体机制尚未阐明。因胃予等体积生理盐水。
此,本研究通过尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)
高脂高糖饮食共同诱导构建糖尿病小鼠模型,探讨分别于给药前及末次给药2h后,血糖仪检测
杜仲黄***对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响,为FBG。眼眶静脉采集小鼠血液,离心,取血清待测。
T2DM的防治提供新思路及基础数据。切除部分胰腺组织,制备成10%的匀浆液。另切取
-80℃
部分胰腺组织,保存待测。
1
(FNS)、抗氧化因子及FBG检测
将分离所得的血清复溶,采用ELISA法,按说
明书操作分别检测血清中FNS、T-AOC含量及
雄性昆明小鼠,SPF级,18~22g,购自浙江大
SOD、CAT活性。
学实验动物中心,合格证号:SCXK(浙)2019-
0023。小鼠饲养于通风良好的环境,室温18~
℃腺组织制备成10%匀浆液,采用ELISA法,按说明
25,相对湿度40%~70%,12h/12h光照昼夜循
书操作分别检测胰腺组织中ATP酶、线粒体呼吸链
环。实验开始前所有动物适应性喂养1周。ⅠⅢ
Complex、活性及ROS、ATP含量。
采用醇提取法提取杜仲黄***:首先将干燥杜仲
Mfn1蛋白表达将胰腺组织剪碎后,加入RIPA裂
进行充分粉碎,粉碎药材置于容器中采用70%乙醇℃
∶∶℃解液,置于研磨器中低温充分研磨,0下静置1h。
(药材70%乙醇=115),80加热回流提取2h,连℃
×104r/min,4,离心10min。吸取上清液,BCA
续提取3次。将提取液进行过滤浓缩获得干燥杜仲
蛋白定量、煮蛋白。制备SDS-PAGE凝胶,上样、电
黄***提取物。盐酸二甲双胍片(京丰制药有限公∶
泳、转膜、封闭,加入一抗NRF1(11000)、Mfn1
司,批号:191115);STZ(美国Sigma公司);高脂高∶∶℃
(11000)、β-actin(13000),4下静置孵育12h;
糖饲料(武汉万千佳兴生物科技有限公司,批号:∶
TBST液洗涤,加二抗(12000),室温下慢摇1h,
20191113)。总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶
TBST液洗涤,ECL发光液显色,曝光。GelDocEZ
(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、ROS、ATP酶、ATP
ⅠⅢComplexIⅢ凝胶电泳成像分析系统对目标蛋白灰度/内参灰度
含量、线粒体呼吸链复合物、(、)试
进行灰度。
剂盒(南京建成生物工程研究所);线粒体融合素1
(Mfn1)、NF-E2相关因子1(NRF1)抗体(英国Ab-
,计量资
cam公司)。ˉ±
料以均数±标准差(xs)表示。多组间比较采用单因
素方差分析,若方差齐性,进一步采用Bonferroni法
罗氏卓越型血糖仪(瑞士ACCU-CHEKPerfor-
进行两两比较;若方差不齐,采用Kruska-WallisH
ma);9602A-酶标仪(北京艾普生物设备有限公司);
1493
范春惠,***对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响··
秩和检验;以P<。);与模型组比较,二甲双胍组、杜仲黄***组小鼠
胰腺T-AOC含量增加,SOD、CAT活性提高,ROS含
2
结果量减少(P<);杜仲黄***高剂量组较低剂量组T-
AOC含量及SOD、CAT活性高,ROS含量少(P<
、FNS水平比较
<),见表2。
与空白对照组比较,模型组小鼠给药后的FBG
明显升高、血清中FNS含量减少(P<<
与空白对照组比较,模型组ATP含量明显降
);与模型组比较,二甲双胍组、杜仲黄***组小鼠ⅠⅢ
低,Complex、、ATP酶活力减弱(P<
FBG均降低,血清中FNS含量增加(P<);杜仲
P<);与模型组比较,二甲双胍组、杜仲黄***组
黄***高剂量组FB***平显著低于低剂量组,血清ⅠⅢ
小鼠胰腺ATP含量明显增加,Complex、、ATP
FNS水平高于低剂量组(P<),见表1。
酶活力增强(P<);杜仲黄***高剂量组较低剂量
ⅠⅢ
组ATP含量及Complex、、ATP酶活力高(P<
与空白对照组比较,模型组小鼠胰腺T-AOC含
),见表3。
量减少,SOD、CAT活性降低,ROS含量增加(P<
表15组小鼠FBG、FNS水平比较
ˉ±
xs,n=10
剂量/FBG/(mmol/L)
组别FNS/(μIU/mL)
(mg/kg)给药前给药后
▲▲▲▲
±±##&&±##&
▲▲▲▲
±±**&&±**&&
±±**##±*##
▲▲
杜仲黄***±±**##&±*#&
杜仲黄***±±**##±*##
与空白对照组比较,*P<,**P<;与模型组比较,#P<,##P<;与二甲双
▲▲▲
胍组比较,&P<,&&P<;与杜仲黄***高剂量组比较,P<,P<。
表25组小鼠抗氧化因子及ROS含量比较
ˉ±
xs,n=10
剂量/T-AOC/SOD/CAT/ROS/
组别
(mg/kg)(U/mgpro)(U/mgpro)(U/mgpro)(nmol/mgprot)
▲▲▲▲▲▲▲
±##&±##&&±##&&±##&&
▲▲▲▲▲▲▲▲
±**&&±**&&±**##&&±**&&
±*##±**##±**##±**##
▲▲▲▲▲
杜仲黄***±**##&±**##&&±**##&±**##&&
杜仲黄***±*##±**##±**##&±**##&
与空白对照组比较,*P<,**P<;与模型组比较,#P<,##P<;与二甲双胍组比较,&P<,&&P<;与杜
仲黄***高剂量组比较,▲P<,▲▲P<。
表35组小鼠线粒体功能因子水平比较
ˉ±
xs,n=10
ⅠⅢ
剂量/ATP/Ca2+-ATP酶/Complex/Complex/
组别
(mg/kg)(μmol/gprot)(μmolPi/mgprot)(nmol/min/mgprot)(nmol/min/mgprot)
▲▲▲
±##&±##±##&±##&
▲▲▲▲▲▲▲▲
±**&&±**&&±**&&±**&&
±*##±##±*##±*##
▲▲▲▲▲
杜仲黄***±**#&±##&±**##&&±*##&
杜仲黄***±*##±##±*##±*##
与空白对照组比较,*P<,**P<;与模型组比较,#P<,##P<;与二甲双胍组比较,&P<,&&P<;与杜
仲黄***高剂量组比较,▲P<,▲▲P<。
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、Mfn1蛋白表达量比ROS产生所致的氧化应激相关。
较线粒体是机体的能量代谢中心,在不同的生理
与空白对照组比较,模型组胰腺NRF1、Mfn1蛋或病理状态下,线粒体具有调节其功能及在不同内
白表达量显著降低(P<);与模型组比较,二甲环境下调整能量供应的能力[10]。胰岛素抵抗(IR)及
双胍组、杜仲黄***组小鼠胰腺线NRF1、Mfn1蛋白表T2DM病程的进展与线粒体功能异常有着重要的关
达明显升高(P<);杜仲黄***高剂量组较低剂量系[11]。胰腺组织线粒体的肿胀、外膜破裂、线粒体
组NRF1、Mfn1蛋白表达高(P<<),见DNA损伤、呼吸链抑制等,线粒体生成和氧化磷酸
表4、图1。化能力下降,会造成能量代谢障碍,形成一系列相
互作用的损伤过程[12]。
表45组小鼠胰腺组织NRF1、Mfn1蛋白表达量比较线粒体代谢失衡是造成胰腺代谢功能异常的
ˉ±
xs,n=10重要原因。线粒体的氧化还原反应平衡遭到破坏
剂量/
组别NRF1Mfn1时,过量的强氧化分子ROS生成,组织内氧化和抗
(mg/kg)
[13]
▲▲氧化系统之间的动态平衡被打破。ROS的异常堆
±##&&±##&&
▲▲▲▲
±**&&±**&&积,氧化应激损伤破坏其内部的蛋白、线粒体DNA
±*##±**##和线粒体膜上脂类,酶类、呼吸链复合物活性及氧
▲▲
**##&**##&
杜仲黄***±±,其合成ATP的能力下降,GSK-3
杜仲黄***±*##±**##
蛋白激酶的蛋白质磷酸化效率降低,进而影响胰岛
与空白对照组比较,*P<,**P<;与模型组比
素信号通路、葡萄糖代谢、胰岛β细胞功能等胰腺代
较,#P<,##P<;与二甲双胍组比较,&P<,&&P<
[14-15]
▲▲▲谢功能,可导致T2DM的发生及发展。T-AOC
;与杜仲黄***高剂量组比较,P<,P<。
能反应机体抗氧化能力及脂质过氧化损伤程度,其
在机体中的含量与机体的抗氧化能力呈正相关。
ⅠⅢ
Complex、是位于线粒体内膜的线粒体呼吸链
酶,对线粒体活性氧及终端的电子受体的生成有着
重要的作用。本研究结果表明,杜仲黄***能提高
T2DM小鼠血清中抗氧化因子T-AOC含量及增加
SOD、CAT的活性,同时增加胰腺线粒体中Com-
A:空白对照组;B:模型组;C:二甲双胍组;D:杜仲黄***ⅠⅢ
低剂量组;E:杜仲黄***高剂量组。plex、及ATP酶活性及ATP含量,降低ROS的
图1Westernblotting蛋白电泳图含量。提示,杜仲黄***能提高机体的抗氧化能力及
降低ROS的含量,恢复线粒体正常的代谢功能。
3讨论胰岛细胞线粒体数量下降是糖尿病发病及病
程进展的重要条件[16]。研究表明,T2DM患者胰腺
研究表明,杜仲黄***在治疗骨质疏松、急性肺
中线粒体体积、数目明显低于正常人,可认为线粒
损伤及糖尿病方面有显著疗效,并均有降血压、降
体分裂与融合的动力学状态失衡,而线粒体分裂融
血脂、抗肿瘤、强筋健骨及降血糖等丰富药理作
合动力学的失衡是引起胰岛素抵抗,诱发T2DM形
用[6]。最新研究表明,杜仲黄***可纠正糖尿病小鼠
成的始动因素之一[17]。线粒体生物合成因子和融合
糖脂代谢紊乱,通过改善氧化应激状态对胰岛细胞
因子的表达在一定程度上代表线粒体的数量及功
及肾脏组织具有保护作用,但其潜在作用机制尚未
能状态,是平衡线粒体呼吸所产生的氧自由基的
完全明确[3,7]。研究认为,线粒体氧化应激产生的过
量,保证膜结构完整及维持正常膜电位,防止细胞
多ROS是导致胰岛素抵抗、β细胞结构受损及功能
凋亡的重要因子[18]。线粒体间的融合依赖于定位于
障碍的关键因素[8-9]。因此,本研究旨在深入研究杜
线粒体外膜的融合蛋白Mfn1。当Mfn1受损时,增
仲黄***抗糖尿病机制是否与改善线粒体功能,减少
加ROS的生成,进一步加重线粒体功能障碍[19]。线
1495
范春惠,***对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响··
粒体生物合成因子NRF1广泛参与线粒体的生物合streptozotocin-diabetogenicmicethroughpromotinginsu-
成,与核基因启动子结合,正性调控基因转录,增加linexpressionandamelioratingmetabolicfunction[J].
线粒体生成数量[20]。本研究结果表明,杜仲黄***能FoodChemToxicol,2013,60(10):341-347.
[6],.
增加胰腺中NRF1、Mfn1蛋白表达。提示,杜仲黄***陈丽刘超糖尿病对运动能力的影响及作用机制
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综上所述,杜仲黄***能降低T2DM小鼠血糖,
ogyandMetabolism,2020,40(3):193-196.
增加血清胰岛素、T-AOC含量及CAT、SOD活性,同
ⅠⅢ[7]陈茉,杨俊超,—线粒体质量控制相关
时增加胰腺中ATP含量及ATP酶、Complex、活性论述2型糖尿病的发病机制[J].临床医学研究与实践,
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杜仲黄***抗T2DM的作用机制可能为干预线粒体CHENM,YANGJC,-
融合与分裂、减少ROS生成及堆积、提高机体抗氧sisoftype2diabetesbasedonthecorrelationofspleen-
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