文档介绍：细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
简单实验步骤如下:
- 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
:3min*3
%Triton:25min-+5mlpBS
:2*5min
:37度,20分钟
,4度过夜,一般要大于18小时或者37度 1-2小时
PBS洗净,3min*5次
37度小于一小时
PBS洗净,3*5min
凉干封片()
活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备
(一)制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
↓
用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度为
5×106~1×107/ml
↓
取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50μl)
的小玻璃管或塑料离心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
稀释)灭活正常兔血清
↓4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2ml左右
1000rpm×5min
↓
弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠
(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇
↓ 4℃ 30min
用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右
1000rpm×5min
↓
加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入
1ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,
视细胞浓度加入100~500μl固定液)
↓
FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
(标本在试管中可保存5~7天)
(二)试剂和器材
1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。
3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(三)注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO4 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO4 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度 5%)
4%NaN3???50ml (%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2%)
甲醛 10ml
NaN3 (%)
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(三)注意事项
1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
附:
1. DPBS (×10, 贮存液)
NaCl 80g
KCl 2g 蒸馏水加至1000ml
Na2HPO4 临用时用蒸馏水1∶10稀释
KH2PO4 2g
2. 洗涤液
DPBS 900ml
FCS 50ml (终浓度 5%)
4%NaN3???50ml (%)
3. 固定液
DPBS 1000ml
葡萄糖 20g (终浓度2%)
甲醛 10ml
NaN3 (%)
严重同意楼上的讲解。我是做流式细胞分析的间接荧光,图简单加一抗后只洗涤一次,二抗后没有洗涤,就直接加另外一个抗体,结果做了好多次就是呈阴性反应!排除了好久才多洗涤了两次,结果很是令人满意。
我想请问楼上:NaN3哪里有卖?谢谢!我找过,发现它是一种化学工业产品,成桶成桶的卖,而且有剧毒啊!是不是不是同一种东东?
我做的是zo-1的免疫荧光,步骤如下:
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时,从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次,每次10分