文档介绍：目录
第一章样品制备 2
一般性原则 2
样品制备程序 3
培养细胞样品处理方法 3
组织样品处理方法 3
文献报道较多的裂解液配方 4
第二章第一向等电聚焦(IEF) 7
IPG胶条的水化和电泳 7
仪器 7
试剂 7
实验步骤 7
IPG胶条的平衡 9
仪器 10
试剂 10
实验步骤 10
第三章第二向 SDS 电泳 12
垂直 SDS-PAGE 12
溶液 12
灌胶步骤 12
电泳步骤 14
第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测 15
考马斯亮兰染色 15
经典的考马斯亮兰染色程序 15
Neuhoff 胶体考染法 15
热考马斯亮兰染色及二次染色法 16
硝酸银染色 16
Appendix I Troubleshooting 18
Appendix II Solutions 23
2DE 分析流程:
样品制备(Sample preparation)
固相 pH 梯度胶条的水化(IPG strip rehydration)
第一向等电聚焦(IEF)
第一向胶条的平衡( IPG strip equilibration)
第二向 SDS 电泳(SDS-PAGE)
检测染色(Detection/Staining)
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第一章样品制备(Sample Preparation)
一般性原则:
样品制备是双向电泳中最为关键的一步,这一步处理的好坏将直接影
响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法,尽管处理方法是多种多
样,但都遵循几个基本的原则:1)尽可能的提高样品蛋白的溶解度,抽
提最大量的总蛋白,减少蛋白质的损失;2)减少对蛋白质的人为修饰;3)
破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用,并使蛋白质处于完全变性状
态。
根据这一原则,样品制备需要四种主要的试剂:离液剂(chaotropes),
主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea); 表面活性剂(sufactants),
也称去垢剂,早期常使用 NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂,近几年
较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂;还原剂
(reducing agents), 最常用的是二硫苏糖醇(DTT), 也有用二硫赤藓
糖醇(DTE)以及磷酸三丁酯(TBP)等。当然,也可以选择性的加入
Tris-base,蛋白酶抑制剂( 如 EDTA 、 PMSF or Protease inhibitor
cocktails)以及核酸酶。
样品的来源不同,其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理
组合,以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中,必
须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质,比如核酸、脂、
多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径,盐浓度过
高会降低等电聚焦的电压,甚至会损坏 IPG胶条;这样都会造成 2-DE 的
失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理,超声处理应控制好条件,并防
止产生泡沫;而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多
糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度,但时间太长;也可以
采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐,但会造成蛋白质的部分损失。
因此,处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要
求来进行选择。
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样品制备程序:
培养细胞(culture cell)样品处理方法:
培养动物组织细胞由于没有细胞壁,因此可以将细胞收集下来,直接
加入裂解缓冲液(Lysis buffer)抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方,
本实验室主要采用如下成份:
(A) 7M Urea,2M Thiourea,4%( w/v)CHAPS,40mM Tris-Base,
40mM DTT,2% Pharmalyte pH 3-10.
其他常用的裂解缓冲液如下:
(B) urea, 2%(w/v) CHAPS, %