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篇一:培养基的制备与灭菌实验报告
陕西师范大学远程教育学院
生物学实验报告
报告题目培养基的制备与灭菌
姓名刘伟
学号
专业生物科学
批次/层次
指导教师
学****中心
培养基的制备与灭菌
一、目的要求
。
。
。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基:
是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基~有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质~所以可供细菌生长繁殖之用。
高压蒸汽灭菌:
主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内~通过加热~使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽~关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出~压力增大~沸点升高~获得高于100?的温度导致菌体蛋白凝固变性~而达到灭菌的目的。
三、实验材料
:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。
:天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三
角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
:药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤
,一,玻璃器皿的洗涤和包装
1(玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中(用毛刷刷洗~然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡~再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿臵于烘箱中烘干后备用。
2(灭菌前玻璃器皿的包装
,1,培养皿的包扎:培养皿由一盖一底组成一套~可用报纸将几套培养皿包
成一包~或者将几套培养皿直接臵于特制的铁皮圆筒内~加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
,2,移液管的包扎:在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)~它的作
用是避免外界及口中杂菌进入管内~并防止菌液等吸入口中。~棉花自身长度约1~。塞棉花时(可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜~吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条~然后将已塞好棉花的移液管尖端
放在长条报纸的一端~约成45?角~折叠纸条包住尖端~用左手握住移液管身~有手将移液管压紧(在桌面上向前搓转~以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条~折叠打结~准备灭菌。
,二,液体及固体培养基的配制过程
1(液体培养基配制
,1,称量,假定配制1000ml培养基,
、
蛋白胨、,或1000ml刻度搪瓷杯,中(牛肉膏常用玻棒挑取~放在小烧杯或表面皿中称量~用热水溶化后倒入烧杯。
,2,溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量,如约700ml,~用玻棒搅匀~然后~在石棉网上加热使其溶解~将药品完全溶解后~补充水到所需的总体积,1000ml,,如果配制固体培养基时~将称好的琼脂放人已溶的药品中~再加热溶化~最后补足所损失的水分。
,3,调pH
调pH:一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸~然后用镊子夹取此段pH试纸~在培养基中蘸一下~观看其pH范围~如培养基偏酸或偏碱时~可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节pH时~应逐滴加入NaOH或HCI溶液~防止局部过酸或过碱~破坏培养基中成分。边加边搅拌~并不时用pH试纸测试~-。反之~用1mol,LHCl进行调节。
2(固体培养基的配制
配制固体培养基时~应将已配好的液体培养基加热煮沸~再将称好的琼脂(~2,)加
入~并用玻棒不断搅拌~以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化~最后补足因蒸发而失去水分。
,三,培养基的分装
根据不同需要~可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内~分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口~造成污染。如操作不小心~培养基沾污管口或瓶口时~可用镊子夹一小块脱脂棉~擦去管口或瓶口的培养基~并将脱脂棉弃去。
1(试管的分装
取一个玻璃漏斗~装在铁架上~漏斗下连一根橡皮管~橡皮管下端再与另一玻璃管相接~橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时~用左手拿住空试管中部~并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内~以右手拇指及食指开放弹簧夹~中指及无名指夹佐玻璃管嘴~使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定~若所用试管大小为15×150mm时~液体培养基可分装至试管高度1,4左有为宜,如分装固体或半固体培养基时~在琼脂完全融化后~应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1,5(约3—4mI)~半固体培养基分装量为管高的1,3为宜。
2(三角瓶的分装
用于振荡培养微生物时~可在250m1
用于制作
平板培养基用时~可在250m1三角瓶中加入150ml
粉(按2,计算)~灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
,四,棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎
为了培养好气性微生物~需提供优良通气条件~同时为防止杂菌污染~则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。
1(试管棉塞的制作
制棉塞时~应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块~铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上~用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞(然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入~也可用折叠卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞应紧贴管壁~不留缝隙~以防外界微生物沿缝隙侵入~棉塞不宜过紧或过松~塞好后以手提棉塞~试管不下落为准。棉塞的2,3在试管内~1,3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。
将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆~外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期~灭菌待用。
2(三角瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布~再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量~则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上~目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。
在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上~再包上一层牛皮纸并用线绳捆好~灭菌待用。
,五,培养基的灭菌
~l21?~20min高压蒸气灭菌。
灭菌过程:
:首先将内层锅取出~再向外层锅内加入适量的水~使水面没过加热蛇
管~与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位~加水量过少~灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。
:放回内层锅~并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤~以免妨碍蒸
汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放臵时要防止液体溢出~三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触~以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。
:将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内~摆正锅盖~
对齐螺口~然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓~使螺栓松紧一致~勿使漏气~并打开排气阀。
:打开电源加热灭菌锅~将水煮沸~使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排
气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时~表明锅内的空气已排尽~沸腾后约需5分钟。
:冷空气完全排尽后~关闭排气阀~继续加热~锅内压力开始上升。
:当压力表指针达到所需压力时~控制电源~开
始计时并维持压力至所
需的时间。~?~20分钟灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力~因此锅内的冷空气必须完全排尽后~才能关闭排气阀~维持所需压力。
:达到灭菌所需的时间后~切断电源~让灭菌锅温度自然下降~当压力
表的压力降至“0”后~方可打开排气阀~排尽余下的蒸汽~旋松螺栓~打开锅盖~取出灭菌物品~倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后~才能打开排气阀~开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降~使容器内的培养基或
试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口~造成瓶口被污染~甚至灼伤操作者。
,六,斜面和平板的制作
1(斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管~趁热臵于木棒或玻棒上~使成适当斜度~凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l,2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时~灭菌后则应垂直放臵至凝固。
2(平板的制作
将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后~待冷至50?左右倾入无菌培养皿中。温度过高时~皿盖上的冷
凝水太多,温度低于50?~培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行~左手拿培养皿~右手拿三角瓶的底部或试管~左手同时用小指和手掌将棉塞打开~灼烧瓶口~用左手大拇指将培养皿盖打开一缝~至瓶口正好伸入~倾入10~15mL培养基~迅速盖好皿盖~臵于桌上~轻轻旋转平皿~使培养基均匀分布于整个平皿中~冷凝后即成平板。
,七,培养基的灭菌检查
灭菌后的培养基~一般需进行无菌检查。最好取出1~2管(瓶)~臵于37?温箱中培养1~2天~确定无菌后方可使用。
篇二:微生物实验报告
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
专业:学号:姓名:
一、实验目的
探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学****培养基的制备、消毒和灭菌~细菌的分离与培养~细菌群体和个体形态特征的观察~细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法~培养对微生物实验的兴趣。
二、实验材料
器材
打火机、油性笔、酒精灯、接种环、接种针、污物盘、普通冰柜、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯CX21型生物
显微镜、电炉、试管,带棉塞,、称量纸、药勺、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、尺子、锥形瓶、高压蒸汽灭菌器、镊子、玻片、吸水纸、拭镜纸
试剂药品
普通营养琼脂培养基、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、石蜡油、生理盐水、结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红、葡萄糖微量发酵管,2支,、乳糖微量发酵管,2支,、青霉素抗菌素纸片、链霉素抗菌素纸片、庆大霉素抗菌素纸片、血浆、福氏志贺菌诊断血清
三、方法与步骤
干粉培养基?蒸馏水?加热溶化?分装?集中放在试管筐里?罩上硫酸纸、牛皮纸?用橡皮筋扎好?放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内?送到高压蒸汽灭菌室,洗刷室,?灭菌?
,1,平板培养基:倾注平板10ml?琼脂完全凝固后~平板倒放?4?冰箱保存备用。
,2,斜面培养基:培养基趁热斜放?琼脂凝固以后~4?冰箱保存备用。
?贴上标签后灭菌使用。
?空气的细菌学检查
每组1个营养琼脂平板~选择采样地点,实验室、卫生间或任选地点,?将平板盖打开~盖朝下放臵在平板旁边?
平板暴露于空气中15min?平板倒扣盖上?作标记?37?温箱培养24h?观察结果。
?人体体表的细菌学检查
甲乙常规洗手~丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板
按规定在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前~第2格为洗手后~第3格为消毒后~第4格空白对照。
接种环烧灼灭菌?分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红美蓝平板上~各做两份~?烧掉接种环上多余的标本?冷却后~应用分区划线分离法~将脓汁标本接种于营养琼脂平板,2份,~粪便标本接种于伊红美蓝平板,2份,?接种环烧灼灭菌?将平板倒臵37?培养18,24h?观察结果。
接种环烧灼灭菌?挑选平板上典型的四种单菌落,白色、黄色、紫黑色、粉红色,进行斜面接种纯培养?做好标记?接种环烧灼灭菌?斜面培养基臵于37?培养过夜?保存备用
?革兰氏染色:
取洁净载玻片?用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上?挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀?待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合?结晶紫初染1min?水洗?卢戈碘液媒染1min?水洗?95,乙醇脱色约
20s?水洗?稀释品红?复染1min?水洗?吸干,镜检。
?肉汤接种法:
接种环烧灼灭菌?分别在斜面培养物中挑取菌苔少许?立即移入肉汤培养基管中?在接近液面的管壁上轻轻研磨?沾取少量肉汤调和?混匀?试管口通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?35?培养4~6h
接种环烧灼灭菌?分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布?接种环烧灼灭菌?标记:青、链、庆?镊子火焰消毒?贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片?按压?镊子消毒?倒臵37?培养18,24h?观察结果
取干净玻片一张?在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴~生理盐水1滴?接种环烧灼灭菌?冷却?分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2,3个菌落的菌量)与血浆研磨混合?边混匀边观察结果?接种环烧灼灭菌?稍等片刻~观察结果
接种针烧灼灭菌?用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔?分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内?接种环烧灼灭菌?将微量管平放在平板内?37?培养过夜后?观察结果。
接种针烧灼灭菌?分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌?从半固体培养基中心垂直刺入~可刺达近底管处~但不要到达管底?循原来的路线退出接种针?试管口迅
速通过火焰2-3次灭菌?塞好棉塞?烧灼灭菌接种针?37?培养24h?观察结果
取洁净的载玻片一张?将磨面近端设为对照区?滴加生理盐水15ul?远端设为试验区?滴加福氏志贺菌诊断血清15ul?接种环烧灼灭菌?用接种环分别取粉红色菌苔?研磨于盐水或血清内~混合均匀?接种环烧灼灭菌?载玻片来回倾侧?观察结果
四、结果与讨论
对脓汁中细菌的分析讨论
1、用普通平板~从脓汁标本中分离出金黄色和白色两种菌落。
2、在显微镜下观察时~这两种细菌均为G+球菌~排列不规则~呈葡萄串状~是典型的葡萄球菌。
3、结合菌落的颜色~可以初步断定~这是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
4、通过血浆凝固酶试验~观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质~说明为凝固酶阳性,白色菌落则没有凝集反应~说明其为凝固酶阴性。
5、最后进行的是药敏试验~从培养基上可以观察到~不同的抗生素所形成的抑菌圈不同。其中青霉素对金黄色葡萄球菌最敏感。
对粪便中细菌的分析讨论