文档介绍：western显影常见现象、原因及解决方案
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子,发现在这一块还没
有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案,是
我的经验总结,以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的,
其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数,语言
比较简洁,如对其中内容有疑问或建议可跟帖。
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物
敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做
法是如果看到荧光则压10~30s,看不到则同时压两张,10~30min洗
一张,如果无则再补一张,1h后洗。再无,则压过夜。共3张片,根据
每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子(以
供贴胶带),然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边(贴时胶
带留一半用于粘到封口膜上),然后将片子压到膜上,并使透明胶带
留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片,就不会因为
放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片,与第一张
片子贴在一起就行,注意片子要干燥,压片前用纸擦干封口膜,以避
免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可
以把上面片子与下面一张错开了,不要用手抠,否则下面一张也移动
了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带,否则在胶
带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减,所以
下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - ---
-- -- --- -- ---解决
反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - -
---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - -
- - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2
信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - -
- -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- -
- - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - -
- ---- -优化转膜条件*注5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - -
-- - ----测试活性或选用敏感底物*注6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - -
- - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - --
- - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - -
- - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- -
--- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - -
------ -- --降低暴光时间*注11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - --
--- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12
条带内无显影的白点