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:
1石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置60°C1小时)。
二甲苯I、II,各10分钟。
梯度酒精:100%,2分钟t95%,2分钟t80%,2分钟t70%2分钟。
蒸馏水洗:5分钟,2次(置于摇床)。
2•过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2,室温10分钟(避光)。:5分钟,2次(置于摇床)。
:根据待检测的抗原,选择适当的方法。
附:抗原修复液()的配制(1)储备液的配制:
A液:枸橼酸三钠-+蒸馏水1000ml
B液:枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
(2)工作液的配制:A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复的方法:
(1)高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却(可用自来水在高压锅外冲,以助冷却)。
(2)微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液;再选择中高或高档,5分钟.(最佳温度为92~95°C)
(3)酶消化处理:此略。
抗原修复的注意事项:
(1)组织不能干。
(2)选择抗原修复方法要因抗体而异。
(3)该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
抗原修复后至DAB显色的过程中,均需用PBS缓冲液。
:5分钟,2次(置于摇床)。:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态),滴加正常山羊或兔血清(与第二抗体同源动物血清)处理,37C,15分钟。
附:正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)
按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50卩1+5卩1(10%抛洒量)计算。
:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37C2小
时
(也可置于4°C冰箱过夜)。
:5分钟,2次(置于摇床)。,37C,40分钟。
:5分钟,2次(置于摇床)。
(SAB复合物),37C,40分钟。
PBS:5分钟,2次(置于摇床)。
DAB显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止)。
附:DAB的配制
(1)储备液(DAB25mg/ml)的配制:DAB250mg+PBS10ml,待完全溶解后分装成lml,100pl,50pl,20卩1等,一20C,冻存。
(2)工作液:DAB储备液20卩1+PBS1000^1+3%也025卩1
自来水(细水)充分冲洗。
苏木素复染,室温,30秒,自来水冲洗。
自来水冲洗返蓝,15分钟。
梯度酒精脱水:
80%,2分钟t95%,2分钟t100%,2次,5分钟。
二甲苯透明:
I,II(二甲苯)各5分钟
封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。
细胞爬片的免疫组化染色:
取出细胞爬片,迅速置入冷***固定20~30分钟。
蒸馏水浸泡5分钟,2次。
打孔液浸泡5分钟。
蒸馏水浸泡5分钟,2次。
后接前述实验步骤的第6步(正常血清封闭)。
注:第3、4步仅用于检测细胞内抗原,检测细胞膜抗原时不用。
冰冻切片的免疫组化染色:
新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80C保存),厚度为5〜6pm。
载玻片可不打底,裱片后,立即用电吹风吹干。
如不马上染色,可密封后-20C保存。
染色前用冷***在4°C固定10-20分钟。
PBS洗2次,每次5分钟,(%柠檬酸钠+%triton打孔)
3%H2o2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光;
用PBS洗2次,每次5分钟;
:
洗衣粉液浸泡30分钟,冲洗,晾干。
洗液(含强酸、高锰酸钾等)浸泡24小时,冲洗,晾干。
APES(1:50***溶液)10-20秒(注意:不能用塑料容器及塑料切片架)
纯***I,约10秒。纯***II,约5秒
晾干或烤箱内烤干,备用。