文档介绍：毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒
用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白
综述:
基本特征:
作为真核生物,毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点:如蛋白加工、折叠、翻译
后修饰等。不仅如此,操作时与及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织
培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价,且表达水平更高。同为酵母,毕赤酵母具有
与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点,且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术:
许多技术可以通用:
互补转化基因置换基因破坏另外,在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如:HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶;两者中基因产物有交叉互补;酿酒酵母中的一些野
生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补,如 HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3 等基因
在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母:
毕赤酵母是甲醇营养型酵母,可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是:醇氧
化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛,还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性,甲醛代谢主要
在一个特殊的细胞器-过氧化物酶体-里进行,使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于
醇氧化酶与 O2 的结合率较低,因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化
物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白:
毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶-AOX1 及 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是
AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达,较典型的是占可溶性
蛋白的 30%以上。AOX1 基因已被分离,含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白
的目的基因的表达。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性,但在甲醇中带 AOX2 基因
的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
表达:
AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有 5%的 polyA+ RNA
来自 AOX1 基因。AOX1 基因调控分两步:抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说,在含
葡萄糖的培养基中,即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此,用甲醇进行优化诱导时,推
荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时,仍不足以使 AOX1 基因达
到最低水平的表达,诱导物甲醇是 AOX1 基因可辨表达水平所必需的。
AOX1 突变表型:
缺失 AOX1 基因,会丧失大部分的醇氧化酶活性,产生一种表型为 Muts 的突变株
(methanol utilization slow),过去称为 Mut,而 Muts 可更精确地描述突变子的表型。结果
细胞代谢甲醇的能力下降,因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+(methanol utilization plus)
指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的
整合方式。
蛋白胞内及分泌表达:
外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列,将
外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用,包括几种外源蛋白本身分
制作者:陈苗商汉桥
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒
泌信号序列,利用酿酒酵母α因子前原肽信号序列也获得许多成功。
分泌表达外源蛋白的最大优点是:毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白,加上毕赤酵母最
小生长培养基中只有少量的蛋白,这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成
份,也可算作蛋白纯化的第一步。注意,如果外源蛋白一级结构中有可识别的糖基化位点
(Asn-X-Ser/Thr),则这些位点可能发生糖基化。
翻译后修饰:
与酿酒酵母相比,毕赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有优势,因为不会使其过糖基化。
酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型,然而毕赤酵母中蛋白转录后所增
加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基)比酿酒酵母中的(50-150 个甘露糖残
基)短得多。
另外,酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3 聚糖连接头,而毕赤酵母则没有。一般认为酿酒
酵母中糖基化蛋白的α-1,3 聚糖接头与蛋白的超抗原性有关,使得这些蛋白不适于治疗应用。
虽