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一、基因工程1、(a)基因工程的诞生
(一)基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。
2、(a)基因工程的原理及技术
原理:基因重组
技术:(一)基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
(3)结果:经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较:
①相同点:都缝合磷酸二酯键。
②区别:E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DN***段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DN***段的末端,形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
(1)载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点,供外源DN***段插入。③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒
(二)基因工程的基本操作程序
第一步:目的基因的获取
:编码蛋白质的基因。
(1)从基因文库中获取目的基因
(2)PCR技术扩增目的基因
(3)如果基因较小,核苷酸序列已知,用化学方法直接人工合成。
(1)原理:DNA双链复制
(2)过程:第一步:加热至90~95℃DNA解链;第二步:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步:基因表达载体的构建
:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
:目的基因+启动子+终止子+标记基因
(1)启动子:是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子:也是一段有特殊结构的DN***段,位于基因的尾端。
(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
第三步:将目的基因导入受体细胞_
:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
:
将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
将目的基因导入微生物细胞:用Ca2+处理,使之成为感受态细胞。
,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
第四步:目的基因的检测和鉴定
,方法是采用DNA分子杂交技术。
,方法是采用分子杂交技术。
,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。
。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
(三)(b)基因工程的应用
:抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。
、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
:把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥作用,从而达到治疗疾病的目的。
(四)(a)蛋白质工程的概念
蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。(基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)(1)蛋白质工程崛起的缘由:基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质
(2)蛋白质工程的基本原理:它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构,又称为第二代的基因工程。
基本途径:从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。以上是蛋白质工程特有的途径;以下按照基因工程的一般步骤进行。(注意:目的基因只能用人工合成的方法)
设计中的困难:如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列
二、细胞工程(一)植物细胞工程
(原理):细胞全能性
(b)(1)过程:离体的植物器官、组织或细胞―――→愈伤组织―――→试管苗――→植物体
(2)用途:微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。
A植物繁殖微型繁殖:可以高效快速地实现种苗的大量繁殖
作物脱毒:采用茎尖组织培养来除去病毒(因为植物分生区附近的病毒极少或没有)
人工种子:以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料,经人工薄膜包装得到的种子。优点:完全保持优良品种的遗传特性,不受季节的限制;方便储藏和运输
B作物新品种培育单倍体育种:
a过程:植株(AaBb)通过减数分裂得到花粉(AB、Ab、aB、ab四种类型);对花粉进行花药离体培养(技术是植物组织培养);得到单倍体植株;对其幼苗时期进行秋水仙素处理;得到了正常的纯合二倍体植株(AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型)。
b优点:明显缩短育种年限
C突变体利用:在组织培养中会出现突变体,通过从有用的突变体中选育出新品种(如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体)
D细胞产物的生产:通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养,从而让它们能够产生大量的细胞产物。
(3)地位:是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
②
植物细胞A
植物细胞B
杂种细胞
愈伤组织
杂种植株
①
③
④
⑤
图(2)
(1)过程:
(2)诱导融合的方法:物理法包括离心、振动、电激等。化学法一般是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。
(3)意义:克服了不同生物远缘杂交的障碍。
(二)(a)
(1)概念:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
(2)动物细胞培养的流程:取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞进行传代培养。
(3)细胞贴壁和接触抑制:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
(4)动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养:合成培养基成分:糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度:适宜温度:℃+℃;pH:~。
④气体环境:95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
(5)动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。
(2)选用去核卵(母)细胞的原因:卵(母)细胞比较大,容易操作;卵(母)细胞细胞质多,营养丰富;含有激活细胞核表达全能性的物质。
(3)体细胞核移植的大致过程是:
高产奶牛(提供体细胞)进行细胞培养;同时采集卵母细胞,在体外培养到减数第二次分裂中期的卵母细胞,去核(显微操作)[注:为什么要用卵细胞?它可以提供充足的营养;操作简便;含有激活细胞核表达全能性的物质;将供体细胞注入去核卵母细胞;通过电刺激使两细胞融合,供体核进入受体卵母细胞,构建重组胚胎;将胚胎移入受体(代孕)母牛体内;生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛
(4)体细胞核移植技术的应用:①加速家畜遗传改良进程,促进优良畜群繁育;②保护濒危物种,增大存活数量;
③生产珍贵的医用蛋白;④作为异种移植的供体;⑤用于组织器官的移植等。
(5)体细胞核移植技术存在的问题:
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
(1)动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞。
(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。
(3)动物细胞融合的意义:突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为可能,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
为制备单克隆抗体开辟了新途径。
(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较:
细胞工程
植物体细胞杂交
动物细胞融合
理论基础
细胞的全能性、细胞膜的流动性
细胞增殖、细胞膜的流动性
融合前处理
酶解法去除细胞壁(纤维素酶、果胶酶)
注射特定抗原,免疫处理正常小鼠
诱导手段
物理法:离心、振动、电激
化学法:聚乙二醇(PEG)
物理法:离心、振动电激
化学法:聚乙二醇
生物法:灭活的病毒(灭活的仙台病毒)
诱导过程
第一步:原生质体的制备
(酶解法)
第二步:原生质体融合
(物、化法)
第三步:杂种细胞的筛选和培养
第四步:杂种植株的诱导与鉴定
正常小鼠免疫处理
动物细胞的融合
(物、化、生法)
杂交瘤细胞的筛选与培养
专一抗体检验阳性细胞培养
单克隆抗体的提纯
用途和意义
克服远缘杂交的不亲和障碍,大大扩展杂交的亲本组合范围
应用:白菜-甘蓝等杂种植株
制备单克隆抗体
诊断、治疗、预防疾病,例如“生物导弹”治疗癌症
(1)抗体:一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
(2)单克隆抗体的制备过程:
对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白(目的使小鼠产生了浆细胞);提取B淋巴细胞;同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取;促使它们细胞融合[注:融合的结果是有很多不符合要求的;如有2个B淋巴细胞融合的细胞等,所以要进行筛选];在特定的选择培养基上筛选出融合的
杂种细胞[特点是能迅速大量增殖,又能产生专一的抗体];然后对它进行克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞];最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖,从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。
(3)杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。
(4)单克隆抗体的优点:特异性强,灵敏度高,并能大量制备。
(5)单克隆抗体的作用:作为诊断试剂:准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物:主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。
三、胚胎工程
胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术,如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎,还需移植到雌性动物体内生产后代,以满足人类的各种需求。
(一)动物胚胎发育的基本过程
(1)精子的发生:补充,精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂;变形过程中,细胞核为精子头的主要部分,高尔基体发育为顶体,中心体演变为精子的尾,线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜,其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。[线粒体为精子运动提供能量]
(2)卵子的发生:在胎儿时期,卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围],减一分裂在排卵前后完成,形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精;减二分裂是在受精过程中完成的。
(3)受精:精子获能(在雌性动物生殖道内);卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力);受精阶段[卵子周围的结构由外到内:放射冠、透明带、卵细胞膜],a顶体反应:精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质,穿越放射冠。
b透明带反应:顶体酶可将透明带溶出孔道,精子穿入,在精子触及卵细胞膜的瞬间,阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障];c卵细胞膜的反应:精子与卵细胞膜接触,精子入卵后,卵细胞膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障];精子尾部脱落,原有核膜破裂形成雄原核,同时卵子
完成减二分裂,形成雌原核注意:受精标志是?
(4)胚胎发育的基本过程:受精场所是母体的输卵管。
a卵裂期:细胞进行有丝分裂,数量增加,胚胎总体积不增加或略有缩小;
b桑椹胚:32个细胞左右的胚胎[之前每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能属全能细胞];
c囊胚:细胞开始分化,其中个体较大的细胞叫内细胞团,将来发育成胎儿的各种组织;而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘;胚胎内部逐渐出现囊胚腔[注:囊胚的扩大会导致透明带的破裂,胚胎伸展出来,这一过程叫孵化];
d原肠胚:内细胞团表层的细胞形成外胚层,下方的细胞形成内胚层,由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。[细胞分化在胚胎期达到最大限度]
(二)胚胎工程的应用
(1)卵母细胞的采集和培养:主要方法:用促性腺激素处理,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取卵子,直接与获能的精子在体外受精。第二种方法:从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞,都要在体外经人工培养成熟后,才能与获能的精子受精。
(2)精子的采集和获能:采集:假***法、手握法和电刺激法;
获能对啮齿动物、家兔、猪等的精子用培养法(放入人工配制的获能液中);对牛、羊等精子用化学法(放在肝素或钙离子载体A23187溶液中)
在体外受精前,要对精子进行获能处理。
(3)受精:获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
(4)胚胎的早期培养:精子与卵子在体外受精后,应将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂,除一些无机盐和有机盐外,还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分,以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到
桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植,小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植,人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)
(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”。(供体为优良品种,作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。)
地位:如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必须经过胚胎移植技术才能获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”。
(2)胚胎移植的意义:大大缩短了供体本身的繁殖周期,充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(3)生理学基础:①动物发情排卵后,同种动物的供、受体***官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体内的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
(4)基本程序主要包括:
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。