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生物技术实践
一、传统发酵技术
:
1〕原理:酵母菌的无氧呼吸
2〕菌种来源:附着在葡萄皮上的野生酵母菌或人工培育的酵母菌。
3〕条件:18-25℃,密封,每隔一段时间放气〔CO 〕
2
4〕检测:在酸性条件下,***钾与酒精反响呈灰绿色。
2、果醋制作:
1〕原理:醋酸菌的有氧呼吸。
氧气,糖源充分时,将糖分解成醋酸
氧气充分,缺少糖源时,将乙醇变为乙醛,再变为醋酸。
2〕条件:30-35℃,适时通入无菌空气。
3、腐乳制作:
1〕菌种:青霉、酵母、曲霉、毛霉等,主要是毛霉〔都是真菌〕。
2〕原理:毛霉产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和aa;脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3〕条件:15-18℃,保持确定的湿度。
4〕菌种来源:空气中的毛霉孢子或优良毛霉菌种直接接种。
5〕加盐腌制时要逐层加盐,随层数加高而增加盐量,盐能抑制微生物的生长,避开豆腐块***变质。
4、泡菜制作:
1〕原理:乳酸菌的无氧呼吸。
使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响。②将颖蔬菜放入盐水中后,盖好坛盖。向坛盖边沿的
水槽中注满水,以保证乳酸菌发酵的无氧环境。
2〕制作过程:①将清水与盐按质量比4:1配制成盐水,将盐水煮沸冷却。煮沸是为了杀灭杂菌,冷却之后
3〕亚***盐含量的测定:
①方法:比色法;
②原理:在盐酸酸化条件下,亚***盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反响后,与N-1-萘基乙二***盐酸盐结合形
成玫瑰红色染料。
二、微生物的培育与应用
1、培育基的种类:按物理性质分为固体培育基和液体培育基,按化学成分分为合成培育基和自然培育基,按
用途分为选择培育基和鉴别培育基。
2、培育基的成分一般都含有水、碳源、氮源、无机盐P14。
3、微生物在固体培育基外表生长,可以形成肉眼可见的菌落。
4、培育基还需满足微生物对PH、特别养分物质以及氧气的要求。
5、获得纯洁培育物的关键是防止外来杂菌的入侵。
6、常用灭菌方法有:灼烧灭菌,将接种工具如接种环、接种针灭菌;干热灭菌:如玻璃器皿、金属用具等需
保持枯燥的物品。高压蒸汽灭菌:如培育基的灭菌。
7、用固体培育基对大肠杆菌纯化培育,可分为两步:制备培育基和纯化大肠杆菌。
8、固体培育基的制备:计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
9、微生物常用的接种方法:平板划线法和稀释涂布平板法。
10、平板划线法是通过连续划线,将菌种逐步稀释分散到培育基外表,稀释涂布平板法是将菌液进展一系列
的梯度稀释,分别涂布到培育基外表。当它们稀释到确定程度后,微生物将分散成单个细胞,从而在培育基上
形成单个菌落。
11、微生物的计数方法:活菌计数法、显微镜直接计数法、滤膜法。
菌。通过统计平板上的菌落数,就能推想出样品中大约含有多少个活菌。统计的菌落数往往比活菌的实际数目
低。由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观看的只是一个菌落。
12、活菌计数法就是当样品的稀释度足够高时,培育基外表生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活
13、显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法,但它包括了死亡的微生物。
14、设置比照的主要目的是排解试验组中非测试因素对试验结果的影响。提高试验结果的可信度。
①如何证明培育基是否受到污染:试验组的培育基中接种要培育的微生物,比照组中的培育基接种等量的蒸馏
水〔设置空白比照〕。
②如何证明某选择培育基是否有选择功能:试验组中的培育基用该选择培育基,比照组中培育基用一般培育基
〔牛肉膏蛋白胨培育基〕。假设一般培育基的菌落数明显大于选择培育基中的数目,则说明该选择培育基有选
择功能。
15、如何分别分解尿素的细菌?培育基中以尿素为唯一氮源,参与酚红指示剂,假设PH上升,指示剂变红,
可初步鉴定该菌能分解尿素。
16、如何分别分解纤维素的微生物?以纤维素为唯一碳源的培育基。
17、纤维素酶是一种复合酶,至少包括三组分:C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维
二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
18、筛选纤维素分解菌的方法:刚果红染色法,其原理是刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复
合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反响。当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红—纤维素的复
合物无法形成,培育基中会消灭以纤维素分解菌为中心的透亮圈。〔产生了透亮圈,说明纤维素被分解了,说
明有纤维素分解菌〕
三、植物组织培育
1、菊花组织培育一般选择未开花植株的茎上部萌生的侧枝。
2、常用的培育基是MS培育基:主要成分包括:大量元素:N、P、K、Ca、Mg、S;微量元素:B、Mn、
Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co;有机物:如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素以及蔗糖等,常常还要添加植物激素。
3、生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。
1〕依据不同的挨次使用,会得到不同的试验结果。
①先使用生长素,后使用细胞分裂素:有利于细胞分裂,但细胞不分化;
②先使用细胞分裂素,后使用生长素:细胞既分裂也分化。
③同时使用:分化频率提高。
2〕两者用量的比例影响细胞的发育方向:
4、花粉是单倍体的生殖细胞,花粉的发育要经受小孢子四分体时期,单核期和双核期等阶段。
5、通过花药培育产生花粉植株〔单倍体植株〕一般有两种途径:
到底是哪种途径主要取决于培育基中激素的种类及其浓度配比。
6、影响花药培育的因素:材料的选择和培育基的组成,此外,亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及
接种密度等都有影响。
7、月季的花药培育一般选初花期,并且选择单核期的花粉。选择花药时,一般通过镜检来确定花粉是否处于
适宜的发育期。确定花粉发育时期的常用方法:醋酸洋红法,某些植物的花粉细胞核不易着色,需承受焙花青
——铬矾法,这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
四、酶的争论与应用
1、果胶酶作用:分解果胶,瓦解植物的细胞壁及胞间层,提高水果的出汁率,并使果汁变得澄清。
2、果胶酶并不特指某一种酶,包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。
3、酶的活性可用单位时间内、单位体积中反响物的削减量或产物的增加量来表示。
4、目前常用的酶制剂有四类:蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶,其中应用最广泛、效果最明显的是碱性
蛋白酶和碱性脂肪酶。
5、加酶洗衣粉的作用原理:碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分
子的肽,使污迹简洁从衣物上脱落。同样道理,脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能将大分子的脂肪、淀粉和纤维
素水解为小分子物质。
6、固定化技术包括:包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说,酶更适合承受化学结合法和物理吸附法
固定化,而细胞多承受包埋法固定化。由于细胞个大,而酶分子很小;个大的细胞难以被吸附或结合,而个小
的酶简洁从包埋材料中漏出。
将海藻酸钠溶液冷却至室温,再参与活化的酵母细胞。CaCl2溶液有利于凝胶珠形成稳定的构造。
7、固定化酵母细胞时,酵母细胞的活化用蒸馏水;配制海藻酸钠溶液时,加热要用小火,或者连续加热;要
五、DNA和蛋白质技术
1、提取生物大分子的根本思路是选用确定的物理或化学方法分别具有不同物理或化学性质的生物大分子。
2、DNA溶解性:①DNA在不同浓度的NaCL溶液中溶解度不同。,溶解度最
小。②DNA不溶于酒精。
3、DNA对酶、高温存洗涤剂的耐受性:由于酶有专一性,蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA没有影响。DNA
比较能耐高温。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA无影响。
4、在沸水浴条件下,DNA遇二苯***会被染成蓝色。
5、提取DNA的材料一般用鸡血而不用猪血,由于哺乳动物〔猪〕成熟的红细胞无细胞核,无DNA。
6、裂开鸡血细胞时,可以参与确定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。
7、为了纯化提取的DNA,需要将滤液进一步处理。在滤液中参与NaCL,使其浓度为2mol/L,过滤除去不溶
的杂质,再参与蒸馏水,,析出DNA,过滤除去溶液中的杂质。
8、向溶解了DNA的NaCL溶液中参与体积分数为95%的冷却的酒精溶液,目的是提取含杂质更少的DNA。
9、PCR原理:DNA体外复制。
10、PCR的条件:①确定的缓冲溶液;②DNA模板;③分别与两条模板链相结合的两种引物;④四种脱氧核
苷酸;⑤耐热的DNA聚合酶;⑥把握温度的仪器设备。
11、为什么要引物?由于DNA聚合酶不能从头开头合成DNA,而只能从3′端延长DNA链。DNA的合成方向
总是从子链的5′端向3′端延长。
12、PCR三步骤:变性、复性和延长。在PCR循环之前,常要进展一次预变性,以便增加大分子模板DNA
彻底变性的概率。
13、PCR的结果:特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。
14、DNA在260nm的紫外线波段有一猛烈的吸取峰。
15、蛋白质分别的方法:凝胶色谱法和电泳。
慢,后洗脱出来;相对分子质量较大的蛋白质,移动速度快,先洗脱出来。
16、凝胶色谱法是依据相对分子质量的大小分别蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质,移动速度
17、电泳利用了待分别样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小外形的不同,使带电分子产生不
同的迁移速度,从而实现各种分子的分别。
六、植物有效成分的提取。
1、植物芳香油的提取方法:蒸馏、压榨和萃取。
2、水蒸汽蒸馏法是利用水蒸汽将挥发性较强的植物芳香油携带出来,形成油水混合物,冷却后又重分出油
层和水层。如玫瑰油、薄荷油等〔也可用萃取法〕。
3、柑橘、柠檬芳香油的制备常使用压榨法,由于水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解。
4、胡萝卜素的提取一般用萃取法。萃取法是将粉碎、枯燥的植物原料用有机溶剂浸泡,使芳香油溶解在有机
溶剂中,然后蒸发出有机溶剂,猎取纯洁的植物芳香油。
5、石油醚具有较高的沸点,能充分溶解胡萝卜素,并且不与水混溶,所以适宜用作胡萝卜素的萃取剂。
6、玫瑰精油的化学性质稳定,难溶于水,易溶于有机溶剂,能随水蒸汽一同蒸馏。故适用于蒸馏法。
7、玫瑰精油的油水混合物中参与NaCL目的是增加水层密度,使油水分层。分别油层后加无水Na2SO4,目
的是除去水,再过滤去除Na2SO4。
8、橘皮压榨前用石灰水浸泡,目的是破坏细胞构造、分解果胶、防止橘皮压榨时滑脱,提高出油率。
9、胡萝卜素是橘黄色结晶,化学性质比较稳定,不溶于水,微溶于乙醇,易溶于石油醚等有机溶剂,所以适
于用萃取法。
10、萃取时承受水浴加热,以防有机溶剂燃烧、爆炸。瓶口安装回流冷凝装置,以防止加热时有机溶剂挥发。