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ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
ISSN1005-9903,CN11-3495/R
《中国实验方剂学杂志》网络首发论文
题目:诃子、甘草与制草乌合用调控心脏代谢酶CYP2J3减毒机制
作者:李晗,宋玲,高云航,陈腾飞,侯红平,彭博,叶祖光,张广平
DOI:.
收稿日期:2022-07-13
网络首发日期:2022-10-08
引用格式:李晗,宋玲,高云航,陈腾飞,侯红平,彭博,叶祖光,、甘
草与制草乌合用调控心脏代谢酶CYP2J3减毒机制[J/OL].中国实验方剂学杂
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网络首发时间:2022-10-0815:49:08
网络首发地址:.
[收稿日期]2022-07-13
[基金项目]中国中医科学院科技创新工程项目(CI2021B015);中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目(CI2021A04802);
国家自然科学基金项目(82204740)
[第一作者]李晗,副研究员,从事中药药理与毒理研究工作,E-mail:******@
[通讯作者]*张广平,研究员,从事中药药理与毒理研究工作,E-mail:******@
诃子、甘草与制草乌合用调控心脏代谢酶CYP2J3减毒机制
李晗,宋玲,高云航,陈腾飞,侯红平,彭博,叶祖光,张广平*
(中国中医科学院中药研究所,北京100700)
[摘要]目的:基于心脏细胞色素P450(CytochromeP450,CYP450)系统分别考察诃子、甘草与制草乌
及有效成分鞣花酸、甘草苷与***合用的减毒机制研究。方法:在体内实验方面,大鼠随机分为空白组,
制草乌组(·kg-1),诃子组(·kg-1),甘草组(·kg-1)和诃子+甘草+制草乌合用组(·kg-
1+·kg-1+·kg-1,以制草乌为标准),给药8d后测定大鼠心肌酶(Creatinekinase,CK)与乳酸脱
氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH),观察大鼠心脏组织的病理学改变,并选择Realtime-PCR和蛋白免疫
印迹法(Westernblot)检测CYP2J3mRNA和蛋白表达水平的变化;在体外实验方面,设空白组、***组、
鞣花酸组、甘草苷组与***+鞣花酸+甘草苷合用组,利用高内涵分析技术检测其对细胞数目、DNA含量、
活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)和线粒体膜电位(Mitochondrialmembranepotential,MMP)的影响,
同时检测CYP2J3mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:体内实验中,与空白组相比,制草乌组大鼠血清中
CK和LDH均显著性升高(P<,P<),合用组的CK和LDH活性降低;同时病理染色结果显示诃子
和甘草可减轻制草乌导致的心脏毒性;Real-timePCR结果显示,与空白组相比,制草乌可下调CYP2J3mRNA
转录水平(P<),与诃子、甘草合用后可上调该亚型的表达(P<);蛋白翻译水平与mRNA转录水
平基本一致。体外实验中,高内涵分析结果显示,与空白组相比,***组的细胞数量、DNA含量与MMP
的荧光值显著降低(P<),合用组的细胞数量、DNA含量与MMP的荧光值也显著降低(P<,P<),
但其相应荧光值均高于***组;同时与空白组相比,***下调CYP2J3mRNA转录水平(P<),合用
组能够逆转***下调CYP2J3mRNA的能力(P<)。结论:诃子、甘草与制草乌合用减毒机制主要是鞣
花酸、甘草苷与***合用后,上调了CYP2J3表达,促进花生四烯酸(Arachidonicacid,AA)代谢生成环
氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoicacids,EETs),进而降低心脏毒性的作用,且这种作用可能起始于转录
环节。
[关键词]制草乌;诃子;甘草;细胞色素P450酶;CYP2J3
[中图分类号]R22;R242;R2-031;R287[文献标识码]A
[doi].
DetoxificationmechanismofChebulaeFructus,GlycyrrhizaeRadixetRhizomaandpreparedAconiti
KusnezoffiiRadixCoctainregulatingcardiacmetabolicenzymeCYP2J3
LIHan,SONGLing,GAOYunhang,CHENTengfei,HOUHongping,PENGBo,YEZuguang,
ZHANGGuangping*
(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract]Objective:BasedonthecardiaccytochromeP450(CYP450)system,toinvestigatethemechanism
ofreducingtoxicityofChebulaeFructus,GlycyrrhizaeRadixetRhizomaandPreparedAconitiKusnezoffiiRadix
Cocta,andthecombinationoftheeffectivecomponentsellagicacid,:invivo
experiments,ratswererandomlydividedintointocontrolgroup,preparedAconitiKusnezoffiiRadixCoctagroup
(·kg-1·d-1),ChebulaeFructusgroup(·kg-1·d-1),GlycyrrhizaeRadixetRhizomagroup(·kg-
1·d-1)andcombinationgroup(·kg-1+·kg-1+·kg-1)Creatinekinaseandlactatedehydrogenasewere
detected,observethepathologicalchangesofrathearttissue,andselectreal-timePCRandWesternblottodetectthe
,thecontrolgroup,
aconitinegroup,ellagicacidgroup,liquiritingroupandcombinationgroupweresetup,andtheeffectsoncellnumber,
DNAcontent,reactiveoxygenspeciesandmitochondrialmembranepotentialweredetectedbyhighcontentanalysis
technology,:
invivo,comparedwiththecontrolgroup,theserumCKandLDHinthereparedAconitiKusnezoffiiRadixCocta
groupweresignificantlyincreased(P<,P<),andtheactivityofCKandLDHinthecombinedgroupwas
decreased;Atthesametime,thepathologicalstainingresultsshowedthatChebulaeFructusandGlycyrrhizaeRadix
etRhizomacouldreducethecardiactoxicitycausedbythepreparedAconitiKusnezoffiiRadixCocta;Theresultsof
real-timePCRshowedthatcomparedwiththecontrolgroup,preparedAconitiKusnezoffiiRadixCoctacoulddown
regulatethetranscriptionlevelofCYP2J3mRNA(P<),andupregulatetheexpressionofCYP2J3mRNA(P<)
whencombinedwithTChebulaeFructusandGlycyrrhizaeRadixetRhizoma;Theproteintranslationlevelwas
,theresultsofhighcontentanalysisshowedthat
comparedwiththecontrolgroup,thecellnumber,DNAcontentandMMPfluorescencevalueoftheaconitinegroup
weresignificantlydecreased(P<),andthecellnumber,DNAcontentandMMPfluorescencevalueofthe
combinedgroupwerealsosignificantlydecreased(P<,P<),butthefluorescencevalueswerehigherthan
thoseoftheaconitinegroup;Atthesametime,comparedwiththecontrolgroup,aconitinecoulddownregulatethe
transcriptionlevelofCYP2J3mRNA(P<),andthecombinedgroupcouldreversetheabilityofaconitinetodown
regulateCYP2J3mRNA(P<).Conclusion:themechanismofreducingtoxicityofthecombinationofChebulae
Fructus,GlycyrrhizaeRadixetRhizomaandpreparedAconitiKusnezoffiiRadixCoctaismainlythatthecombination
ofellagicacid,liquiritinandaconitinecanupregulatetheexpressionofCYP2J3,promotethemetabolismof
arachidonicacidtoproduceepoxyeicosatrienoicacids,andthenreducethecardiactoxicity,andthiseffectmaystart
fromthetranscriptionallink.
[Keywords]preparedAconitiKusnezoffiiRadixCocta;ChebulaeFructus;GlycyrrhizaeRadixetRhizoma;
CytochromeP450;CYP2J3
蒙医药是蒙古族人民宝贵的文化遗产,也是我国民族医药的重要组成部分[1]。草乌,蒙药名为泵嘎,是
蒙医药的常用药材之一。[2],具有杀“黏”、
燥黄水及止痛等功效[3]。现代研究发现草乌的主要成分是以***为代表的双酯型生物碱,该类成分既是药
理成分也是毒性成分。因为草乌具有“毒”与“效”并存的特点,蒙医药多用诃子汤炮制法,诃子及甘草与其合
用等方式来降低草乌的毒性[4-5]。诃子,蒙药名为“阿如拉”,为使君子科植物绒毛诃子TerminaliachebulaRetz.
。诃子具有调和三根、解毒之功效,因此
被誉为“蒙药之王”[6]。诃子果实中含有近30%的鞣质,其中具有抗氧化、抗炎作用的鞣花酸为代表成分之一
[7]。,在中药与蒙医药中均具有解毒功效。甘草苷
作为甘草黄***类的代表成分之一,具有心脏保护的药理作用[8]。
本课题组前期研究发现草乌可下调肝脏CYP(cytochromeP450,CYP)的表达,而诃子、甘草与草乌配
伍后可上调其表达,减少乌头类生物碱在体内的蓄积时间,起到减毒的作用[9]。但是对于草乌的毒性靶器官
心脏,诃子、甘草与其合用之后能否可通过调控心脏CYP产生减毒增效的作用尚未进行研究。在心脏CYP
系统中CYP2J家族主要参与AA的代谢,并可生成四种不同的环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoicacids,
EETs)(5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET),而EETs在心肌疾病中具有重要的生理病理作用。因此
有必要对诃子、甘草与制草乌及有效成分合用后对心脏CYP2J3的调控作用进行进一步研究。
1材料
健康成年SpragueDawley大鼠,SPF级,雄性,40只,鼠龄8~10周,体重(200±20)g,购自北京维
通利华实验动物技术有限公司,动物许可证编号:SCXK(京)2021—0011。饲养于中国中医科学院中药研究
所SPF级动物房,大鼠饲养条件:12h明暗交替,温度(23±1)℃,湿度50%±15%,自主饮水及进食。动
物实验相关操作通过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会的批准,批准号:2021B032。大鼠心肌细胞
H9c2,购于中国医学科学院基础医学研究所,细胞复苏后传至3代用于后续实验。
,甘草为豆科植物GlycyrrhizauralensisFisch.
的干燥根和根茎,草乌为毛茛科植物北乌头AconitumKusnezoffiiReich的干燥块根。诃子与草乌购于安国市
同利中药材有限公司,甘草购自北京同仁堂公主坟中医门诊部有限公司复兴路药店分公司,经中国中医科学
院中药研究所叶祖光研究员鉴定,草乌购置后由内蒙古蒙药股份公司经与诃子汤炮制后使用。
***(批号:110720-200410,规格:20mg)购于中国药品生物制品检定所;鞣花酸(批号:L941795,
规格:5g),甘草苷(批号:L468830,规格:10mg)购于北京百灵威科技有限公司。
胎牛血清与DMEM培养基(美国Gibco公司);胰蛋白酶(上海SangonBiotech公司);CCK-8细胞增
殖试剂盒(日本Dojindo公司,批号:CK04-202107);苏木素、伊红染液(安徽雷根生物技术有限公司,批
号:0128A21、0226A21);CK-MB与LDH试剂盒(北京碧云天科技有限公司);Hoechst33342染料(北京碧
云天科技有限公司,批号:040320200713);MitoTrackerTMRedCMXRos、CellROX®GreenReagents染料(美
国Invitrogen公司,批号:2256813、2201587);RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司,批号:U9225);
逆转录与Realtime-PCR试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司,批号:P20329、M51219);BCA蛋白
定量试剂盒(美国ThermoScientific公司,批号:VJ312549);一抗CYP2J3兔抗鼠(美国Proteintech公司,
批号:00094025);一GAPDH抗鼠(北京碧云天科技有限公司,批号:AF0006);二抗HRP-labeledGoatAnti-
RabbitIgG抗体(上海Abcam贸易有限公司,批号:ab205718);其他试剂均为国产分析纯。
RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);Bioprep-24生物样品均质仪(杭州奥盛仪器有限公司);
Finesse325切片机、VaristainGeminiES全自动染色机与HERAcell150i细胞培养箱(美国Thermo公司);
VIP-6全自动脱水机(日本樱花公司);KD-BM石蜡包埋机(科迪仪器设备有限公司);NIKONCI-S型倒置
显微镜(日本尼康公司);Microfuge22R型台式高速离心机(美国Beckman公司);CKX53型倒置显微镜(日
本Olympus公司);MK100-4A微孔板恒温孵育器(上海珂淮仪器有限公司);Cytation5细胞成像多功能检测
系统(美国Bio-Tek公司);NANODROPONE核酸浓度测定仪(美国Thermo公司);SpectraMaxi3x型多标
记酶标仪(美国MolecularDevices公司);CFX96型RealtimePCR仪(美国BIO-RAD公司);Westernblot
电泳仪与转膜仪(美国BIO-RAD公司);AI600多功能成像仪(美国GE公司)。
2方法
制草乌粉:诃子称重后加入8倍量水,浸泡8h,煎煮1h,随后四层纱布滤过,留取诃子汤备用。向诃
子汤中加等量草乌浸泡24h。24h后取出草乌肉切成薄片晾干后打粉,过200目筛得制草乌粉;
诃子粉、甘草粉的制备:分别取适量诃子、甘草粉碎后过200目筛得诃子粉;
诃子-甘草-制草乌粉:取诃子粉、甘草粉与制草乌粉称重后按照诃子∶甘草∶制草乌=1∶1∶1比例混匀。
配伍组分中的给药剂量均以制草乌为基础进行计算[9]。
·mL-1,灌胃时,药物用蒸馏水配制相应浓度,现配现用。
动物到达后适应性观察3天,按体重随机分为5组:空白组、制草乌组、诃子组、甘草组、诃子+甘草+
制草乌合用组。其中制草乌根据中国药典Ⅰ部规定的临床剂量按体表面积换算为大鼠剂量。制草乌组、诃子组、
甘草组剂量均为:·kg-1·d-1,诃子+甘草+制草乌合用组剂量为:·kg-1·d-1+·kg-1·d-1+·kg-
1·d-1,每组8只,假手术组的大鼠灌胃蒸馏水,灌胃体积为每100g大鼠给药1mL,连续灌胃给药8d。末次
给药后大鼠禁食不禁水16h。
大鼠腹腔注射10%的水合***醛3mL·kg-1,待麻醉后打开大鼠腹腔,使用采血管自下腔静脉采血,室温放
置1~3h后离心(4℃,3000r·min-1,离心半径6cm,10min),取200μL的血清,严格按试剂盒说明书测
定血清肌酸激酶(Creatinekinase,CK)与乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)变化。
-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining,HE)及病理学观察
取血完毕后,摘取心脏并纵切心脏,取其一部分转移至4%的多聚甲醛溶液中,固定24h后,进行脱水、
包埋、制成4μm的石蜡切片,行HE染色,光学显微镜下观察组织病理学变化并记录。
H9c2细胞生长于含有10%胎牛血清、1%-1双抗的DMEM培养基中,并于
37℃、5%CO2的条件下培养,待细胞融合至70%~80%时,以1∶3的比例传代,取对数生长期细胞进行实
验,实验时将细胞分为空白组、***组(20μmol·L-1)、鞣花酸组(20μmol·L-1)、甘草苷组(20μmol·L-
1)和合用组(20μmol·L-1)[10]。
***配伍鞣花酸、甘草苷对H9c2细胞的影响
H9c2细胞以2×105个/孔的密度接种于96孔黑色板壁透明底板,常规培养,待细胞融合至80%时,分别
加入***(20μmol·L-1)、鞣花酸组(20μmol·L-1)、甘草苷组(20μmol·L-1)和***+鞣花酸+甘草苷(20
μmol·L-1),48h后弃去原培养基,并用PBS洗细胞。将Hoechst33342、CellROX®GreenReagents及
TM
MitoTrackerRedCMXRos染料加入细胞孔板内(100μL/孔),并于37℃、5%CO2条件下继续孵育,45min
后弃染料混合液,PBS清洗,最后每孔加入100μLPBS后进行检测。本实验采用Gen5软件采集并分析图像。
选择20×物镜,采集条件如下:第一通道波长为350/461nm检测Hoechst33342标记的细胞核并记录细胞数
目、细胞核内DNA含量;第二通道波长为579/599nm检测MMP;第三道波长为485/520nm检测CellROX®
GreenReagents标记的ROS。并运用Gen5软件分析图像的荧光强度,其中细胞数目为第一通道的荧光数目,
细胞核内DNA含量为第一通道的荧光强度,MMP为第三通道中细胞质的荧光强度,ROS为第二通道中细胞
质与细胞核的荧光强度。
-timePCR检测大鼠心脏组织CYP2J3mRNA表达
利用RNA提取试剂盒提取大鼠心脏与H9c2细胞总RNA,利用紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280
~)与浓度。随后将1000ng总RNA逆转录后进行Real-timePCR检测,PCR反应条件为后首先
预变性94℃30s,循环时94℃5s、60℃15s、72℃10s,共40个循环。以各目标基因2-△△Ct值表示各目
标基因mRNA相对表达水平,特异性引物为北京博迈德基因技术有限公司产品,序列见表1[11]。
表1引物序列信息
Table1PrimersequencesusedforQ-PCRreactions
基因名称引物序列(5’~3’)产物长度/bp
上游:GTTGGGGAGAATGGGGAAGTT
CYP2J3268
下游:TCCTGCACATCACAACTCAC
上游:GGCGGCATTAACTCTGTCCT
GAPDH292
下游:TCACAAACATGGGGGCATCA
利用RIPA法提取大鼠心脏与H9c2细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白质定量,随后于100℃、5min条
件下进行变性,50μg蛋白经8%SDS-PAGE电泳分离,将蛋白转移至PVDF膜,室温下脱脂牛奶封闭1h,
分别孵育CYP2J3(1∶1000)一抗,TBST洗膜3次,孵育二抗(1∶2000),ECL发光,显影,最后采用ImageJ
软件计算灰度值,以目标蛋白/GAPDH灰度值的比值表示待测蛋白的相对表达水平。
实验数据以均数±标准差(𝑥̅±s)的形式表示,并采用SPSSStatistics25统计软件对各组数据进行统计分
析,采用单因素方差分析(One-wayANOVA),P<。
3结果
对大鼠血清进行CK和LDH指标检测。与空白组相比,制草乌组大鼠血清中CK和LDH均显著性升高
(P<<);诃子组的LDH显著降低(P<);甘草组的CK显著降低(P<);合用组的CK
和LDH无明显变化(P>>),见表2。
表2诃子、甘草与制草乌合用对大鼠血清心肌酶活性的影响(x±s,n=8)
Table2EffectsofChebulaeFructus,GlycyrrhizaeRadixetRhizomaandpreparedAconitiKusnezoffiiRadixCocta
onserummyocardialenzymeactivityinrats(x±s,n=8)
组别剂量/g·kg-1·d-1CK/U·L-1LDH/U·L-1
空白组-±,±
±)1,±)
±,±)
±)1,±
++±,±
与空白组比较,1)P<,2)P<
空白组,诃子组与甘草组心肌纤维排列整齐,细胞着色均匀,间质未见炎症细胞浸润,组织形态结构正
常;制草乌组可见局灶性或小片状心肌纤维均质红染,心肌细胞排列紊乱,横纹消失,心肌细胞变性;诃子、
甘草与制草乌合用后与制草乌组相比心肌细胞变性程度减轻,变性范围减小,心肌细胞排列紊乱程度改善,
其余未见异常变化,表明诃子和甘草减轻制草乌心脏毒性。见图1。
A:空白组;B:制草乌组;C:诃子组;D:甘草组;E:合用组;
图1诃子、甘草与制草乌合用对大鼠心脏组织病理学的影响(HE,200×)
,GlycyrrhizaeRadixetRhizomaandpreparedAconitiKusnezoffiiRadixCoctaon
cardiachistopathologyinrats(HE,200×)
利用Real-timePCR扩增大鼠心脏中的CYP2J3mRNA。结果显示,与空白组相比,制草乌可显著下调
CYP2J3mRNA表达(P<);诃子组