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血清差异蛋白质谱
安东;袁正伟
【摘要】目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据•方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13d(E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,(),鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展.
期刊名称】《中国医科大学学报》
年(卷),期】2019(048)004
【总页数】6页(P315-319,323)
【关键词】神经管畸形;同位素标记相对和绝对定量技术;蛋白组学
【作者】安东;袁正伟
【作者单位】中国医科大学附属第一医院儿科,沈阳110001;中国医科大学附属盛
京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室,沈阳110004
正文语种】中文
【中图分类】
神经管畸形(neuraltubedefects,NTDs)是儿童常见的畸形,发病率为1%。~5%。[1]。70%~80%的NTDs可能通过产前筛查手段如超声及孕妇血清甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)筛查出来,但目前AFP等产前检查标记物的特异性并不高[2-3]。孕期胎儿和孕妇之间存在相互交换,其交换物质包括细胞内、细胞外因子[4-5]。血清蛋白谱变化能够反应孕妇和胎儿的生理和病理变化。因此,研究孕妇血清蛋白谱变化规律对畸形的早期发现和研究畸形的发生机制具有十分重要的意义。
近年来,蛋白质组学研究对疾病的早期诊断、发病机制探讨有重要意义[6]。本课题组已用蛋白质组学方法对先天性显性脊柱裂(spinabifidaaperta,SBA)胎鼠的脊髓组织及羊水进行了蛋白质表达谱的分析,结果发现了新的特异性的差异表达蛋白[7-8]。本研究采用同位素标记相对和绝对定量(isobarictagforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技术[9],利用维甲酸致畸动物模型,研究比较SBA致畸早期孕11、13d(E11、E13)与正常孕鼠血清蛋白表达谱的变化,以筛选出多种与NTDs相关的差异表达蛋白,为寻找NTDs早期血清蛋白标志物及探讨发病机制奠定了基础。
材料与方法
研究对象
成熟未孕Wistar大鼠(体质量250-300g)由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供,雌雄比例5:1午夜合笼,晨&00***涂片镜下见到精子记为孕0d(E0)。将孕10d(E10)孕鼠随机分为2组,致畸组以维甲酸混悬液(140mg/kg)经胃管灌饲,对照组给予同体积的橄榄油。孕鼠分别于E11、E13行水合***醛腹腔麻醉,心脏穿刺取血,剖宫取出胎鼠,解剖显微镜下辨认胎鼠是否为
BA。血标本用无抗凝剂的5mL普通采血试管,室温放置2h,使血液凝固析出血清,3000g离心20min,,每管200pL,-80°C保存°iTRAQ实验分组为维甲酸致畸组(E11、E13)和正常对照组(E11、
E13),每组5例血清预混。本研究符合中国医科大学实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准。
蛋白质提取与浓度测定:将致畸组和对照组各组内5个样本等体积混合为一个样本,用Proteominer试剂盒去除血清高丰度蛋白,使用Brandford方法进行蛋白浓度测量。
iTRAQ标记、SCX分离与液相串联质谱分析:每个样品取出蛋白100pg,胰蛋白酶酶解消化,按照操作手册进行iTRAQ标记。E11正常对照组(E11N),标记114标签;E11维甲酸致畸组(E11SBA),标记117标签;E13正常对照组(E13N),标记118标签;E13维甲酸致畸组(E13SBA),标记121标签。室温培养2h,标记后的各组肽段混合。采用岛津LC-20AB液相系统、,分离后组分经TripleTOF5600的液相色谱电离串联质谱(LC-ESI-MSMS)分析采集数据。
应用Mascot检索软件,选择数据库Uniprot_RAT(34908sequences)进行数据库搜索,对蛋白质进行鉴定。根据蛋白质丰度水平,当差异倍数>,,视为致畸组与正常对照组之间的表达差异蛋白。对鉴定出的差异蛋白,通过检索GeneOntology数据库和COG数据库,进行GO生物学功能富集分析和COG功能分类分析。
结果
本研究共得到谱图157422张,通过Mascot软件进行分析后,匹配到的谱图数量7303张,其中Unique谱图数量为6013张,共鉴定到2167个肽段,其中含1880个Unique肽段和390个蛋白。对E11、E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白(表1)、E11与E13正常对照组差异蛋白、E11与E13维甲酸致畸组差异蛋白4组资料进行两两比较,共发现显著差异表达的152个蛋白(图1)在这些有差异表达的蛋白中,维甲酸致畸组与正常对照组比较,蛋白APOM和PCSK9在E11和E13同时下调,蛋白FGG和Uncharacterized在E11和E13同时上调,蛋白PLA-2g2a、FGI2、SERPINE2、TUBB5、FGI1和HP在E11下调而在E13上调,见图2。
表1E11、%ofcoverageFolddifferences11SBA/11N13SBA/13NIPI00205036Hemoglobinsubunitalpha-1/-IPI00231192Hemoglobinsubunitbeta--IPI00230897Hemoglobinsubunitbeta---(续表)?
(续表)AccessionUniprot_swissprotdescriptionMascotscore%ofcoverageFolddifferences11SBA/11N13SBA/------
,embryonicday;N,normal;SBA,spinabifidaaperta.
(sPLA2,fibroleukin,GDN,tubulinbetachain,fibrinogen-likeprotein1,andhaptoglobin)(APOM,PCSK9)(fibrinogengammachainandIgheavychainVregionMOPC47A)thatwereupregulatedatbothE11andE13.
GO注释:对差异蛋白质进行GO分析,发现其主要参与的生物学功能包括细胞进程(%)、单有机体过程(%)、应激反应(%)、生物功能调节(%)、发育过程(%)和信号转导(%),见图3。
COG注释:COG注释,差异蛋白主要参与蛋白质翻译后修饰、折叠、分子伴侣和细胞骨架功能,见图4。
讨论目前,比较蛋白质组学应用于出生缺陷研究,在寻找产前诊断标记物、探索胚胎畸形发生机制和治疗靶点等方面已做了大量研究°iTRAQ技术是先进的定量比较蛋白质组学方法之一,优点有定量敏感、标记完全、标记效率高。在本研究中,采用iTRAQ相关技术对脊柱裂动物模型致畸早期的孕鼠血清总蛋白进行鉴定和比较蛋白组学相对定量分析,共鉴定了390个蛋白,其中152个蛋白在不同组间出现显著差异表达。结果表明,将iTRAQ标记串联质谱技术用于NTDs孕鼠血清的比较蛋白组学分析是一种行之有效的方法。
维甲酸致畸组与正常对照组相比,E11鉴定差异表达的蛋白为40个,远远多于E13鉴定差异表达的蛋白26个,说明致畸早期有更多的蛋白分子参与异常神经发育过程。在这些差异蛋白中,部分蛋白曾在NTDs、神经疾病、胚胎发育畸形的蛋白质组学研究中报道。如应用双向电泳和质谱分析技术,对正常对照组和维甲酸致畸组孕17d胎鼠脊髓组织的蛋白质组进行分析,发现了差异蛋白14-3-38蛋白、蛋白二硫化物异构酶(proteindisulphide-isomerase,PDI)家族[8];在唐氏综合征孕妇血清中筛查出标志物富组氨酸糖蛋白(histidine-richglycoprotein)和维生素D结合蛋白(vitaminD-bindingprotein)
[10-11];脐血中发现新生儿特异蛋白Transgelin-2[12];阿尔兹海默病脑脊液筛查出基质Gla-protein前体和结合珠蛋白前体;帕金森病脑脊液筛查出载脂蛋白M和维生素D结合蛋白前体[13]。提示iTRAQ标记技术用于蛋白质相对定量的比较研究有可比性和延续性。用iTRAQ标记技术对致畸早期E11、E13维甲酸致畸孕鼠血清进行相对定量分析,共鉴定出38个在畸形组中表达显著上调的蛋白和28个表达显著下调的蛋白。这些致畸早期差异蛋白可能参与NTDs的发生过程,有望作为NTDs产前诊断的标志物。
图3GO分类图(参与生物学功能)
onbiologicalfunctions
在血清学中鉴定到的差异蛋白,从其GO分类可知这些蛋白质参与细胞进程、应激反应、生物功能调节、发育过程、信号转导等诸多方面的生物过程。所鉴定的差异蛋白中,部分是功能已知与畸形明确相关的分子,如14-3-38蛋白和PDI。14-3-38是哺乳动物神经系统正常发育所必需的一种蛋白质,该蛋白缺失或缺陷时,会发生脑死亡或严重大脑畸形[14]。PDI蛋白具有蛋白质转录后修饰、协助蛋白质折叠、装配、运输功能,进而抑制细胞凋亡、保护细胞、减少应激对器官造成的伤害等多种作用[
15-16]。此外,还有很多新发现的蛋白,其中部分蛋白参与胚胎的正常发育。对这些蛋白进行进一步的验证分析和深入的体内外实验和功能验证研究,将有助于阐明这些蛋白参与和调控脊柱裂发生机制的方式,为NTDs产前诊断与新的靶向治疗打下基础。
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