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A、dyebyCoomassieblue
【Purpose】
掌握用考马斯亮蓝(Coomassieblue)R250染色法观察植物细胞骨架的方法。
【Principle】
细胞骨架(Cytoskeleton)组成:主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。微管主要分布在核周围,呈放射状向四周扩散,微丝主要分布于细胞质膜的内侧,而中间纤维则分布在整个细胞中。
细胞骨架作用:具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。
细胞骨架的研究方法:考马斯亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。
考马斯亮兰R250染色法的原理:考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性,即用非离子去垢剂(如TritonX-100)处理时,可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时,细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来,只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异性染色,但当其它蛋白成分被抽提后,就能清晰地显示微丝束的形态。
[Apparatus,materialandreagent]
光学显微镜;烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片;
新鲜洋葱鳞茎;
6mM磷酸盐缓冲液()、M缓冲液、1%TritonX-100、%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。
[experimentprotocol]
1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于2~(烧杯1);
2、用2~3ml1%TritonX-100处理20min(烧杯1);
3、吸去TritonX-100,用M缓冲液2~3ml洗2次,每次5min(烧杯1);
4、2~3ml3%戊二醛固定40min(烧杯2);
5、~3ml洗2次,每次5min,滤纸吸去残液(烧杯1);
6、2~%考马斯亮蓝R250染色15分钟,然后用蒸馏水小心冲洗1~2次(烧杯1);
7、将表皮铺放在载玻片上,加盖玻片,在高倍显微镜或者油镜下进行观察。
cytoskeleton
Cytoskeletonofonioncell
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