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紫外—可见分光光度计
UltravioletandVisibleSpectrophotometer
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概述
分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同,可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。
特点:
*灵敏度较高(1~10mg·L-1),适用于微量组分的测定。但相对误差较大(2~5%)。
*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点,为常规的仪器分析方法。
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光的吸收定律—Lambert-beer定律
朗伯—比尔定律
当一束平行的单色光照射到有色溶液时,光的一部分将被溶液吸收,一部分透过溶液,还有一部分被器皿表面所反射。设入射光强度为I0,透过光强度为I,溶液的浓度为c,液层宽度为b,经实验表明它们之间有下列关系:
(1-1)
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如果浓度c的单位为mol·L-1,b的单位为cm,这时k常用
表示。称为摩尔吸光系数(molarabsorptivity),其单位为L·mol-1·cm-1,它表示吸光质点的浓度为1mol·L-1,溶液的宽度为1cm时,溶液对光的吸收能力。值越大,表示吸光质点对某波长的光吸收能力愈强,故光度测定的灵敏度越高。值在103以上即可进行分光光度法测定,高灵敏度的分光光度法可达到105~106。于是式(1-1)可写成为:
A=εbc(1-4)
ε与a的关系为:
ε=Ma(1-5)
式中M为吸光物质的摩尔质量
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紫外—可见分光光度计基本构造
单色器
光源
检测器
吸收池
信号显
示系统
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光源(lightsource):
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区:钨灯、卤钨灯、氙灯,其辐射波长范围在320~2500nm。钨灯最适宜的使用波长范围为320~1000nm。
紫外区:氢、氘灯。发射185~400nm的连续光谱。
使用波长范围一般为190~360nm。
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吸收池(absorptioncell)又称比色皿,是由无色透明的光学玻璃或熔融石英制成,用于盛装试液或参比溶液。
玻璃吸收池:在见光范围内使用。
石英吸收池:在紫外光范围内使用。
吸收池,、1cm、2cm、3cm和5cm宽,可适用于不同浓度范围的试样测定。%。
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检测器(detector)把透过吸收池后透射光强度转换成电讯号的装置。
检测系统应具有灵敏度高、对透过光的响应时间短、且响应的线性关系好,对不同波长的光具有相同的响应可靠性。在分光光度计中常用光电管和光电倍增管等做检测器。光电倍增管其灵敏度要比光电管约高200倍。
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显示器(display)显示器是将检测器检测的信号显示和记录下来的装置。在分光光度计中常用的是微安表、数码显示管等。简单的分光光度计多用微安表。在标尺上有透光度(T)和吸光度(A)两种刻度,由于吸光度和透光度是负对数关系,因此透光度的刻度是均匀的,而吸光度的刻度是不均匀的。
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:经单色器分光后的一束平行光,轮流通过参比溶液和样品溶液,以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单,操作方便,维修容易,适用于常规分析。
:经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光,一束通过参比池,一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度,此比值即为试样的透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响,特别适合于结构分析。仪器复杂,价格较高。
:由同一光源发出的光被分成两束,分别经过两个单色器,得到两束不同波长(1和2)的单色光;利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池,然后经过光电倍增管和电子控制系统,最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值ΔA。对于多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)分析,以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下,利用双波长分光光度法,往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计,能获得导数光谱。