文档介绍：DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone)
来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物(常被成为副本或拷贝)。
克隆化(cloning)
获取大量单一拷贝的过程,也称无性繁殖。
DNA克隆(DNAcloning)
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(DNA)与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子(复制子)-重组DNA 。
继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞。
再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆,又称为基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloning)。
※“克隆”某一基因或DNA片段过程中,将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子-嵌合DNA,所以DNA克隆又称重组DNA (binant DNA)。
※实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(binant DNA technology),又称基因工程(ic engineering)。
※基因工程目的:
①分离获得某一感兴趣的基因或DNA
②获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
二、DNA重组技术基本程序
(目的DNA)的获取
(重组DNA)导入合适受体细胞
分、切、接、转、筛
供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因克隆简介
目的基因载体
酶切,连接
重组基因
转入
受体细胞
筛选阳性克隆
分
切、接
转
筛
常用工具酶
限制性内切核酸酶:
能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶,简称内切酶。
DNA连接酶:
能够在DNA双链5’-磷酸基和3’-羟基之间形成3’,5’磷酸二酯键。
封闭DNA的缺口或链接两个DNA片段
T4 DNA 连接酶来源于噬菌体
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的类型
主要特性 I 型 II 型 III 型
限制修饰
多功能
单功能
双功能
蛋白结构
异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子
ATP Mg2+ SAM
ATP Mg2+ SAM
Mg2+
识别序列
TGAN8TGCT
旋转对称序列
6GTGC
CAGCAG
切割位点
距识别序列1kb处
识别序列内或附近
距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的命名
属名种名株名
H i n d III H i n d III
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶