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及其扩增产物物的鉴定分析析
综合性设计性性实验
此实验共包括括如下六个部部分
第一部分,目目的基因选择择
第二部分,PCR引物设设计
第三部分,PCR实验操操作
第四部分,PCR产物电电泳鉴定
第五部分,PCR产物测测序鉴定
第六部分,目目的基因序列列变异分析
第一部分目目的基因选选择
候选基因简介介
在本实验中,,有三个候选选基因,分别别是NGAL,Fascin和Ezrin。
这三个基因在在食管癌及其其他多种肿瘤瘤中呈过表达达,说明它们们在肿瘤的发发生发展中起起重要的生物物学作用。
汕头大学医学学院生物化学学与分子生物物学教研室李李恩民课题组组曾对这三个个基因进行了了深入研究,,在国外杂志志上发表SCI收录研究究论文20余余篇,已形成成系列优势。。
同学们可查阅阅相关资料,,选择感兴趣趣的基因来做做PCR实验验。
NGAL(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)即中性性粒细胞明胶胶酶相关脂质质运载蛋白,,是脂质运载载蛋白(lipocalin)家家族的一个成成员。
NGAL基因因的蛋白产物物具有保护调调节基质金属属蛋白酶-9的活性,作作为小分子铁铁配合物结合合蛋白参与机机体铁代谢和和天然免疫反反应等功能。。另外,NGAL作为一一种早期标志志物还可以帮帮助判定缺血血性肾损伤程程度。
NGAL基基因
NGAL的mRNA信息息在NCBI核酸数据库库中有来自不不同实验室登登记的多个版版本,包含完完整编码区的的有BC033089和和NM_005564等等,编码区长长为597bp,编码码198个氨氨基酸,包含含了N端前部部长为20个个氨基酸的信信号肽序列((为核酸序列列的1-60bp)
信号肽(signalpeptide):某种分泌泌蛋白质及细细胞膜蛋白质质等,以前体体物质多肽的的形式合成,,其N末端含含有作为通过过膜时之信号号的氨基酸序序列,这种氨氨基酸序列称称信号肽或信信号序列(signalsequence))。
NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列:
前20个AA为信号肽序列
2001年汕汕头大学医学学院生物化学学与分子生物物学教研室李李恩民课题组组以永生化食食管上皮细胞胞系SHEE和食管癌癌细胞系SHEEC互互为对照,用用cDNA微微列阵进行行筛选,用RNA印迹迹和RT-PCR进行行鉴定,cDNA克隆隆测序后与GenBank进行BLAST分分析比较。。结果表明NGAL基基因在SHEEC中出现现显著差异过过表达,其cDNA序序列与小鼠24p3、大大鼠NRL(neu-relatedlipocalin)和和人中性粒细细胞NGAL具有较高高的相似性。。这提示NGAL基因因在永生化食食管上皮细胞胞恶性转化中中可能发挥着着重要作用,,可能是一种种新的癌基因因或促癌基因因。
A
B
利用cDNA芯片筛选选两种细胞的的差异表达基基因
ABC
反转录PCR检测NGAL在两种细细胞的mRNA水平
Fascin蛋白的mRNA全长为为2767bp,由5‘‘端非翻译区区111bp碱基,3’’端非翻译区区1174bp碱基,1482bp的全编码序序列区和6个个PloyA信号肽组成成,编码493个氨基酸酸,分子量约约为55kD。
Fascin蛋白定位于于细胞质张力力纤维和细胞胞膜皱褶(ruffles),边缘缘的丝状伪足足(filopodia)、微棘(microspikes)的核心心肌动蛋白束束中。
Fascin基因
以往研究发现现,Fascin基因在在许多上皮来来源的肿瘤细细胞系,
如宫颈癌Hela、胃癌癌AGS、大大肠癌LM1215和SW480、、胰腺
癌BxPC3和T3H4等细胞系中中均上调表达达。
细胞的丝状伪伪足和微棘与与细胞的运动动,癌细胞的的转移有密
切关系,提示示Fascin蛋白可能能在细胞迁移移、细胞粘附附以及
细胞间信息交交流等过程中中发挥作用。。
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Fascin基因的编码码区序列
Fascin基因的蛋白白序列