文档介绍：10级生物技术大实验
实验一无菌操作技术实践
1、掌握无菌操作的整个过程(超净工作台的消毒、操作人员的消毒、无菌接种等)及有关注意事项;
2、了解植物组织培养技术基本原理;
一、实验目的
1、无菌操作:是指用于防止微生物进入无菌范围的操作技术。在多种生物实验中,为了防止微生物生长和繁殖影响实验的进行,要在无菌的环境下进行。
2、无菌操作技术主要应用于植物组织培养技术、微生物培养中
二、实验原理
胚胎培养器官培养组织培养
细胞培养
原生质体培养
微生物培养
大肠杆菌的接种
感受态细胞的制备
重组DNA转化大肠杆菌重组质粒DNA小量提取
植物组织培养
3、植物组织培养:在含有营养物质及植物生长物质的培养液中,培养离体植物组织(器官或细胞)并诱导使其长成完整植株。
4、植物组织培养中应用无菌操作技术的原因:
①植物组织培养中用的植物材料大多由幼嫩组织组成,其离开母体后生存能力弱,易受细菌感染而死亡。
②植物组织培养的培养基营养丰富,真菌、细菌一旦在其中繁殖,很快会将养分耗尽。
1、植物材料:微型月季无菌苗
2、仪器试剂:超净工作台,定时器,酒精灯,灭菌培养皿,人工气候箱,培养基,灭菌废液缸。
三、材料仪器
培养基成分(以本实验中的MS培养基为例)
成分
成分
大量元素
***钾 KNO3
铁盐
乙二***四乙酸二钠
***铵 NH4NO3
硫酸亚铁
磷酸二氢钾 KH2PO4
硫酸镁
有机成分
肌醇
***化钙
甘氨酸
盐酸硫***素 VB1
微量元素
碘化钾 KI
盐酸吡哆醇 VB6
硼酸 H3BO3
烟酸 VB5或VPP
硫酸锰
硫酸锌 H2O
蔗糖
30g/L
钼酸钠 H2O
琼脂
7 g/L
硫酸铜 H2O
活性炭
g/L
***化钴
植物激素
TDZ
1、植物材料选取和培养基的准备
2、超净工作台的清洁和灭菌
打开紫外灯,30 min后关闭紫外灯。
3、操作人员无菌操作前的准备
4、外植体接种
四、实验步骤
、外植体接种具体步骤:
①点燃酒精灯,仔细灼烧刀和镊,晾凉;
②取一只培养皿,在酒精灯火焰上旋转燃烧数秒,至于双臂之间的无菌区,晾凉;
③旋开培养有微型月季的培养瓶瓶盖,扣放在酒精灯边;
④用无菌镊子取一株无菌苗放置在培养
皿中;
⑤ cm左右单
芽茎段,以无菌镊子斜向下45°,形态学
下端向下接种于培养基中,每瓶均匀接
种4个;
⑥将培养瓶瓶口在火焰上旋转燃烧数秒,瓶盖在火焰上燃烧两圈;
⑦盖紧瓶盖,用记号笔在瓶壁标注日期。
⑧灼烧刀和镊子
⑨清理超净工作台,以酒精棉擦拭工作台。
⑩培养瓶置于人工气候箱中培养,7 d后进行观察。
1、培养基及培养皿需在实验前经过高压灭菌;
2、在进行无菌操作时,无菌物与非无菌物应分别放置,手、臂均不可丛无菌区上经过;
3、严禁用手直接拿无菌物品,如无菌苗,而必须用无菌镊子夹取;
4、无菌苗不可暴露在空气中过久,取出后则不可再放回到原培养瓶内,需以镊子夹取丢至废液缸中;
5、接种后需以酒精灯分别灼烧瓶、瓶盖,再拧紧瓶盖;
6、在操作时,严禁喧哗。
五、注意事项