文档介绍：课题研究的主要内容:
1 利用现代分离分析技术对八宝景天中有效抑菌成分进行分离,分析。
2 对植物各浸膏进行抑菌实验,筛选活性抑菌物质。
3 对提取物有效成分进行结构鉴定。
4 最终筛选出具有较好抑菌活性物质,即抑菌剂。
筛菌
一抑菌成分的粗提取
取植物干粉50g,然后按照中药熬制方法(分别加水2000ml、1000ml和1000ml,熬3遍,每遍熬制到200~300ml,3遍滤液合并加热浓缩至500ml)制成水剂,经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌,然后放入冰箱冷藏备用。
二抑菌实验
(1)生长速率法
提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法,设空白为对照。 -1 , -1 , -1 , -1, -1 , -1 , -1 , -1 , -1 , -1 ,9个浓度梯度。
在无菌条件下, 的打孔器打出一定数量的菌饼备用[培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片,放入以平板中央,培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)],待培养基溶化后,从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物,放入培养皿内,然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板,并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上,菌丝一面向下,每皿接1块,每一浓度设3皿,然后加盖并标记,置于23℃恒温光照培养箱中培养,待培养72h后取出培养皿(有些生长较快的病菌培养48h),用菌落计数器量菌落直径(十字交叉量取两次,用其平均数)。按下列公式计算抑制率:
菌落直径(cm)=两次直径平均数- (菌饼的直径)
对照菌落直径-处理菌落直径
抑制率=————————————————×100%
对照菌落直径
(2)孢子萌发法
对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢,每种菌置备3个载玻片,并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合, -1 、 -1 两个浓度梯度,经适当培养后镜检孢子萌发率,以下列公式计算抑制率:
萌发孢子数
孢子萌发率=——————————×100%
检查总孢子数
对照孢子萌发率-处理孢子萌发率
孢子萌发抑制率=————————————————×100%
对照孢子萌发率
实验方案
一八宝景天提取物化学成分的分离
1 提取过程
称取干燥粉碎的植物若干kg,过60目筛,用95%的乙醇浸泡2h,提取液经真空减压浓缩回收乙醇溶剂得到八宝景天提取浸膏,如此反复3次,最终得乙醇浸膏若干kg。取若干kg浸膏,用少量水分散,然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取3次,各萃取液经真空减压浓缩,回收溶剂,分别得石油醚提取浸膏,氯仿提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏,正丁醇提取浸膏、水溶液提取浸膏。
2 分离步骤
取石油醚醚浸膏g以160一200目硅胶拌样,自然晾干,研细。采用200~300目硅胶湿法上柱,依次用石油醚、石油醚一乙酸乙酷(