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2022年8月HEBEIMEDICINEAug.,2022
【文章编号】1006-6233(2022)08-1268-07
柚皮苷调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP轴对甲状腺癌
细胞增殖凋亡迁移侵袭的影响
韦丽1,张建军1,吴锋1,刘宋芳2,杨世峰3
(.陕西省宝鸡市人民医院内分泌糖尿病科,陕西宝鸡721000
1
.陕西省西安市第九医院内分泌科,陕西西安710000
2
.西安交通大学第一附属医院肾内科,陕西西安710000)
3
【摘要】目的:分析柚皮苷通过调节蛋白激酶样内质网激酶真核生物起始因子活化转录
R/2α/
因子增强子结合蛋白同源蛋白()轴对甲状腺癌细胞增
4/CCAAT/PERK/eIF2α/ATF4/CHOPB-CPAP
殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。方法:采用、、、柚皮苷处理细胞,采用
151020μmoL/LB-CPAP5μmoL/L
抑制剂柚皮苷处理细胞作为抑制剂组,另以不加柚皮苷的
PERKGSK2606414+20μmoL/LB-CPAPB-
细胞作为对照组,法检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测各组细胞的
CPAPMTTB-CPAPB-CPAP
凋亡;细胞划痕实验检测各组细胞的迁移情况;实验检测各组细胞的侵袭;
B-CPAPTranswellB-CPAP
法检测各组细胞轴相关蛋白、细胞波形蛋白(
WesternboltB-CPAPPERK/eIF2α/ATF4/CHOPVimen-
)、钙黏蛋白()、钙黏蛋白()、相关蛋白()、细胞淋巴瘤
tinE-E-cadherinN-N-cadherinBcl-2XBaxB-2
()的表达水平。结果:与对照组相比,经、、、柚皮苷处理后,细胞增
Bcl-2151020μmoL/L48hB-CPAP
殖率依次下降[()比()、()、()、(
±%±%±%±%±2.
)],呈浓度依赖性();柚皮苷处理、、,细胞增殖率依次下降
14%P<-CPAP
[()比()比()],呈时间依赖性()。与对照组相比,随柚
±%±%±%P<
皮苷浓度的递增(、、、),细胞凋亡率增加[()比()、(
151020μmoL/LB-±%±%18.
)、()、()],细胞划痕愈合率[()比(
59±%±%±%B-±%±
)、()、()、()]、穿膜细胞数[()个比(
%±%±%±%±±5.
)个、()个、()个、()个]减少,细胞、
±±±-CPAPp-PERK/PERKp-
、、、、蛋白水平逐渐升高,、、蛋白水平
eIF2α/eIF2αATF4CHOPE-cadherinBaxVimentinN-cadherinBcl-2
逐渐降低,呈浓度依赖性()。抑制剂组细胞增殖率[()比(
P<-±%±2.
)]、划痕愈合率[()比()]、穿膜细胞数[()个比(
14%±%±%±±3.
)个]高于组(),细胞凋亡率[()比()]及
0420μmoL/LP<±%±%p-PERK/
、、、、、蛋白水平均低于组,、
PERKp-eIF2α/eIF2αATF4CHOPE-cadherinBax20μmoL/LVimentinN-cad-
、蛋白水平均高于组()。结论:柚皮苷能通过激活
herinBcl-220μmoL/LP</
轴抑制细胞增殖、促进其凋亡,降低细胞迁移、侵袭能力。
CHOPB-CPAPB-CPAP
【关键词】柚皮苷;甲状腺癌;迁移;侵袭
【文献标识码】A【doi】.1006-
EffectofNaringeninRegulationofPERK/eIF2α/ATF4/CHOPAxison
ProliferationApoptosisMigrationandInvasionofThyroidCancerCells
WEILi,ZHANGJianjun,WUFeng,etal
(ThePeople'sHospitalofBaojiCity,ShaanxiBaoji721000,China)
【Abstract】Objective:,,
Toanalyzetheeffectsofnaringinontheproliferationapoptosismigrationand
invasionofthyroidcancercellsB-CPAPbyregulatingproteinkinaseR-likeERkinase/eukaryotictranslation
initiationfactoralpha2/activatingtranscriptionfactor4/CCAAT/enhancer-bindingproteinhomologouspro-
()Methods:,,,
teinPERK/eIF2α/ATF4/-CPAPcellsweretreatedwith151020μmol/L
【基金项目】陕西省自然科学基础研究计划项目,(编号:)
S2019-JC-YB-1405
【通讯作者】吴锋
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,
naringinB-CPAPcellstreatedwith5μmol/LPERKinhibitorGSK2606414+20μmol/Lnaringinwereused
,
astheinhibitorgroupandB-
;
theproliferationofB-CPAPcellsineachgroupflowcytometrywasusedtodetectapoptosisofB-CPAPcells
;;
ineachgroupcellscratchtestwasusedtodetectthemigrationofB-CPAPcellsineachgroupTranswellex-
;
perimentwasusedtodetecttheinvasionofB-CPAPcellsineachgroupandWesternblotmethodwasused
,,,
todetecttheexpressionlevelsofPERK/eIF2α/ATF4/CHOPaxis-relatedproteinsVimentinE-cadherin
,(),()
N-cadherinBcl-2relatedXproteinBaxB-celllymphoma-2Bcl-2inB-CPAPcellsofeachgroup.
Results:,[()
ComparedwiththecontrolgrouptheproliferationrateofB-±%vs.
(),(),(),()]
±%±%±%±%decreasedsequentiallyaftertreat-
,,,,();
mentwith1510and20μmol/Lnaringinfor48inaconcentration-dependentmannerP<
,,,
treatmentwith20μmol/Lnaringinfor12h24hand48htheproliferationrateofB-CPAPcellsde-
[()()()],
±%±%±%inatime-dependentman-
(),[()
nerP<-±%vs.
(),(),(),()]
±%±%±%±%increasedwithnaringinconcentra-
(,,,),[()(),
tionincreasing151020μmol/±%±%
(),(),()]
±%±%±%andthenumberoftransmembranecellsofB-CPAP
[()(),(),(),()],
±±±±±
,,,,
levelsofp-PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4CHOPE-cadherinandBaxproteinsinB-CPAPcells
,,
graduallyincreasedthelevelsofVimentinN-cadherinandBcl-2proteinsinB-CPAPcellsgraduallyre-
,()[(
ducedinaconcentration-dependentmannerP<-±5.
)()],[()()],
38%±%±%±%andnumberof
[()()]
±%±%intheinhibitorgroupwerehigherthanthoseinthe
(),[()()]
20μmol/LgroupP<±%±%andlevelsofp-
,,,,
PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4CHOPE-cadherinandBaxproteinswerelowerthanthoseinthe
,,
20μmol/LgroupthelevelsofVimentinN-cadherinandBcl-2proteinswerehigherthanthoseinthe20
()Conclusion:,
μmol/LgroupP<-CPAPcellspromotetheir
,
apoptosisandreducethemigrationandinvasionabilitiesofB-CPAPcellsbyactivatingthePERK/eIF2α/
ATF4/CHOPaxis.
【Keywords】;;;
NaringinThyroidcancerMigrationInvasion
[]
甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤,女性约,),促进肿瘤生长4,蛋白激酶样
teinresponseUPRR
占发病人数的,近年来,该病发病率逐年增加,死内质网激酶真核生物起始因子活化转录因子
75%/2α/4/
亡率趋于稳定。中国为甲状腺癌高发地区,每年甲状增强子结合蛋白同源蛋白(
CCAAT/proteinkinaseR-
腺癌新增及死亡病例约占全球,严重威胁我国居
[]15%likeERkinase/Eukaryotictranslationinitiationfactoral-
民生命安全1。现代药理学表明,中药有效成分可抑
pha2/activatingtranscriptionfactor4/CCAAT/enhancer
制甲状腺癌的疾病进展,且治疗途径广泛、对患者副作,
[]-bindingproteinhomologousproteinPERK-eIF2α-
用小2。柚皮苷是天然类黄***化合物,能够保护心血)轴在内质网应激中起重要作用,可通过
ATF4-CHOP
管、抗氧化应激、抗炎和抗动脉粥样硬化,且其在食管上调、和其他细胞凋亡相关因子诱导细胞
[C]HOPBcl-2
癌小鼠中具有良好的抗肿瘤活性。研究显示,柚皮苷凋亡5。本研究于年月至年月利用
20191220218
可促进化疗敏感性,柚皮苷联合紫杉醇治疗能够增强柚皮苷处理甲状腺癌细胞,探讨其通过
B-CPAP
对前列腺癌细胞的毒性,抑制癌细胞增殖、转移,提示轴对细胞增殖、
[]PERK/eIF2α/ATF4/CHOPB-CPAP
柚皮苷单独或联合紫杉醇可用于治疗前列腺癌3。凋亡、迁移、侵袭的影响。
内质网中营养、钙、氧及能力状态被破坏称内质网应1材料与方法
激,内质网应激可激活未折叠蛋白反应(11主要材料及仪器:人甲状腺癌细胞株由
unfoldedpro-.B-CPAP
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中国医学科学院提供,柚皮苷(批号:,标记的和,孵育(室温、
110722-201815AnnexinV5μLPI5μL30min
纯度,规格:)购自中国公司,胎避光),采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡
≥98%20mgBeyotimeB-CPAP
牛血清(货号:)购自美国公司,率。
12664025GibcoBRL
化学发光试剂盒(货号:)购自爱必信(上124细胞划痕实验:在孔板中培养各组
ECLabs920..6B-CPAP
海)生物科技有限公司,试剂(货号:)购自细胞,细胞密度为6个孔,在无血清培养液中培
MTTM81801×10/
北京索莱宝科技有限公司,细胞养(、),使用枪头垂直划出两
Annexin-V-FITC/PI24h37℃5%CO2100μL
凋亡检测试剂盒(货号:)购自德国默克公司,条直线,测定此时划痕面积(时划痕面积),药物作
A9210p-0h
单克隆抗体(货号:)、单克隆抗用后拍照,倒置显微镜观察各组细胞迁
PERKAP328p-eIF2α48hB-CPAP
体(货号:)购自上海碧云天生物技术有限公移情况,并测量划痕面积。划痕愈合率()(
AF580348h%=0h
司,单克隆抗体(货号:)、单克划痕面积后划痕面积)划痕面积。
PERKab229912eIF2α-48h/0h×100%
隆抗体(货号:)、单克隆抗体(货号:125实验:细胞经不同浓度柚皮
ab169528ATF4..TranswellB-CPAP
)、单克隆抗体(货号:)、苷处理后,使用试剂盒观察各组
ab184909CHOPab11419Bcl-248hTranswellB-
相关蛋白(,)单克隆抗体细胞侵袭能力。采用胰酶消化细胞,清洗
XBcl-2relatedXproteinBaxCPAPPBS1
(货号)、细胞淋巴瘤(次,无培养基重悬细胞,调整细胞密度至
ab32503B-2B-celllymphoma--2BSA1×
,)单克隆抗体(货号)、细胞波形蛋白5个,向小室(基质胶预先包
2Bcl-2ab3212410/mLTranswellMatrigel
()单克隆抗体(货号)、钙黏蛋白被)上下室分别加入细胞悬液、含培养基,
Vimentinab92547E-150μLBSA
()单克隆抗体(货号)、钙黏蛋培养,乙醇固定,结晶紫染色,倒置显微镜观
E-cadherinab231303N-24h5min
白()单克隆抗体(货号)、察各组穿膜细胞数。
N-cadherinab76011GAPDH
单克隆抗体(货号:)均购自艾博抗(上海)贸易126法检测蛋白表达:收集不同浓度柚
ab8245..Westernblot
有限公司。酶标仪(型号:)购自赛默飞世皮苷处理后的细胞,使用裂解液
MultiskanFC48hB-CPAPRIPA
尔科技(中国)有限公司,流式细胞仪(型号:充分裂解,收集细胞总蛋白,试剂盒检测蛋白浓
Cyt-BCA
)购自美国贝克曼库尔特有限公司,恒温培养箱度。取蛋白在的中分离,将其
oFLEX50mg12%SDS-PAGE
(型号:)购自苏州贝锐仪器科技有限公司。转移至膜,脱脂奶粉室温下封闭,加入稀
BPH-9042PVDF5%2h
12方法释()后的对应一抗孵育过夜,加入稀释(
.1∶10004℃1
121细胞培养与分组:取出冻存的细胞,)后的二抗孵育,试剂盒显影,
..B-CPAP∶20002hECLImageJ
融化后置于培养基(含胎牛血清)中软件分析。
RPMI-164010%
培养,、条件下孵育。于细胞生13统计学分析:分析数据,计量资料以均
37℃5%CO2B-
长至对数生长期时,加入不同浓度的柚皮苷(、、、数标准差()描述,多组间比较采用单因素方差分
1510±x±s
)处理,并以不加柚皮苷的细胞为析,进一步两组间比较行检验。为差
20μmoL/LB-CPAPSNK-qP<
对照组,另采用抑制剂()异有统计学意义。
PERKGSK26064145μmoL/L
柚皮苷处理细胞作为抑制剂组。2结果
+20μmoL/LB-CPAP
122检测细胞增殖:将细胞接种至21柚皮苷对细胞增殖的影响:与对照组相
..MTTB--CPAP
孔板(个孔)中,收集不同浓度(、、、比,经、、、柚皮苷处理后,
20000/1510151020μmoL/L48hB-CPAP
)柚皮苷处理的细胞,及细胞增殖率依次下降,呈浓度依赖性(),
20μmoL/L48hB-CPAPP<
柚皮苷处理、、的细胞,柚皮苷的下降效果最明显;与相
20μmoL/L122448hB-CPAP20μmoL/L20μmoL/L
冲洗后,向每孔加入,孵育,并向比,抑制剂组细胞增殖率升高();
PBSMTT100μL37℃B-CPAPP<
每孔加入二***砜,低速震荡,采用酶标柚皮苷处理、、,细胞增
150μL10min20μmoL/L12h24h48hB-CPAP
仪检测各组细胞处吸光值。殖率依次下降,呈时间依赖性()。见表、表
B-CPAP570nmB-CPAPP<
细胞增殖率柚皮苷处理组细胞吸光值对照组细胞。
=/2
吸光值。22柚皮苷对细胞凋亡的影响:、、、
.B-CPAP1510
123流式细胞术检测细胞凋亡:采用柚皮苷处理的细胞凋亡率均高于
..AnnexinV-20μmoL/LB-CPAP
流式细胞术检测各浓度细胞凋亡对照组(),随柚皮苷浓度的递增,细
FITC/PIB-CPAPP<-CPAP
率。细胞经不同浓度柚皮苷处理后,经胞凋亡率增加,呈浓度依赖性();抑制剂组
B-CPAP48hP<-
洗涤,加入结合缓冲液重悬,并加入细胞凋亡率低于组()。见图
PBS500μLFITCCPAP20μmoL/LP<
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、表。于组()。见图、表。
1320μmoL/LP<
表1不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞表3不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP
增殖情况(,)细胞凋亡情况(,)
n=6x±sn=6x±s
分组增殖率()分组细胞凋亡率()
48h%48h%
对照组对照组
±±
a
1μmoL/±±
abab
5μmoL/±±
abcabc
10μmoL/±±
abcdabcd
20μmoL/±±
抑制剂组e抑制剂组e
±±
F//
注:与对照组比较,;与比较,;注:与对照组比较,;与比较,;
aP<<<<
与比较,;与比较,;与与比较,;与比较,;与
5μmoL/LcP<<<<
比较,比较,
20μmoL/LeP<<
表220μmoL/L柚皮苷处理不同时间后B-CPAP
细胞增殖情况(,)
n=6x±s
时间增殖率()
%
±
a
±
ab
±
F/
注:与处理比较,;与处理比较,图柚皮苷对细胞迁移的影响()
12haP<<-CPAP×200
表4不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP
细胞迁移情况(,)
n=6x±s
分组划痕愈合率()
48h%
对照组
±
a
1μmoL/±
ab
5μmoL/±
abc
10μmoL/±
abcd
20μmoL/±
抑制剂组e
±
图柚皮苷对细胞凋亡的影响
1B-CPAPF/
23柚皮苷对细胞迁移的影响:细注:与对照组比较,;与比较,;
.B-CPAPB-CPAPaP<<
胞划痕愈合率随柚皮苷浓度的递增而减少,呈浓度依与比较,;与比较,;与
5μmoL/LcP<<
赖性();抑制剂组细胞划痕愈合率高比较,
P<-CPAP20μmoL/LeP<
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表5不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP与比较,;与比较,;与
5μmoL/LcP<<
细胞侵袭情况(,)比较,
n=6x±s20μmoL/LeP<
24柚皮苷对细胞侵袭的影响:穿
分组穿膜细胞数(个).B-CPAPB-CPAP
48h膜细胞数随柚皮苷浓度的递增而减少,呈浓度依赖性
对照组
±();抑制剂组穿膜细胞数高于
P<-CPAP
a组()。见图、表。
1μmoL/±<
25柚皮苷对细胞、、
-CPAPVimentinE-cadherinN
5μmoL/±、、蛋白表达的影响:随着柚皮苷浓
abc-cadherinBaxBcl-2
10μmoL/±,细胞、蛋白水平逐渐
B-CPAPE-cadherinBax
abcd升高,、、蛋白水平逐渐降低,
20μmoL/±-cadherinBcl-2
呈浓度依赖性();抑制剂组细胞
抑制剂组eP<-CPAPE-
±、蛋白水平均低于组,
cadherinBax20μmoL/LVimen-
F/、、蛋白水平均高于组
tinN-cadherinBcl-220μmoL/L
注:与对照组比较,;与比较,;()。见图、表。
aP<<<
表6不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞VimentinE-cadherinN-cadherinBaxBcl-2蛋白水平变化(,)
n=6x±s
分组
Vimentin/GAPDHE-cadherin/GAPDHN-cadherin/GAPDHBax/GAPDHBcl-2/GAPDH
对照组
±±±±±
aaaa
1μmoL/±±±±±
ababababab
5μmoL/±±±±±
abcabcabcabcabc
10μmoL/±±±±±
abcdabcdabcdabcdabcd
20μmoL/±±±±±
抑制剂组eeeee
±±±±±
F/.281/.115/
注:与对照组比较,;与比较,;与比较,;与比较,;与
aP<<<<
比较,
eP<
图柚皮苷对细胞侵袭的影响(结晶紫染***柚皮苷对细胞、、
3B-CPAP×4B-CPAPVimentinE-cadherinN-
)、、蛋白表达的影响
400cadherinBaxBcl-2
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26柚皮苷对细胞细胞、、、
.B-CPAPPERK/eIF2α/ATF4/CPAPp-PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4
轴的影响:随着柚皮苷浓度增加,细胞蛋白水平均低于组()。见图
CHOPB-CPAPCHOP20μmoL/LP<
、、、蛋白水、表。
p-PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4CHOP57
平逐渐升高,呈浓度依赖性();抑制剂组
P<-
表7不同浓度柚皮苷处理48h后B-CPAP细胞p-PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4CHOP蛋白水平变化(,)
n=6x±s
分组
p-PERK/PERKp-eIF2α/eIF2αATF4/GAPDHCHOP/GAPDH
对照组
±±±±
aaaa
1μmoL/±±±±
abababab
5μmoL/±±±±
abcabcabcabc
10μmoL/±±±±
abcdabcdabcdabcd
20μmoL/±±±±
抑制剂组e