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·专题研究·
糖通饮含药血清对高糖环境下HBZY-1细胞增殖的
影响及其作用机制
伏红颖1,潘艳伶1,2,陈俞如1,陈洪民1
(,贵州贵阳 550000;,贵州贵阳 550000)
[摘 要]目的 分析糖通饮含药血清对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖的影响及可能作用
机制。方法 将30只SPF级雄性SD大鼠随机均分为空白血清组和糖通饮含药血清组,糖通饮含药血清组大鼠
予以糖通饮灌胃,空白血清组大鼠予以等体积的双蒸水灌胃,灌胃7d后股动脉取血;常规培养第3~15代
HBZY-1细胞分为正常糖+空白血清组、高糖+空白血清组以及高糖+糖通饮含药血清组,按分组给予相应大鼠
血清干预;细胞培养结束后,CCK-8法检测各组细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法检测各组细胞转化生长因
子-β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3mRNA表达,Westernblot法检测各组细胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/
Smad3蛋白表达。结果 与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清组HBZY-1细胞明显增殖,细胞中TGF-
β1、Smad2、Smad3mRNA表达增加,TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达也增加,差异均具有统计
学意义(P<);与高糖+空白血清组相比,高糖+糖通饮含药血清组HBZY-1细胞增殖被抑制,细胞中的
TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA表达降低,TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达也降低,差异均具有
统计学意义(P<)。结论 糖通饮可以抑制高糖状态下HBZY-1细胞的增殖,其作用机制可能与抑制TGF-
β1/Smad信号通路的过度激活有关。
[关键词]肾小球系膜细胞;细胞增殖;糖尿病肾病;大鼠;转化生长因子-β1/Smad信号通路;高糖环境;糖
通饮含药血清
[中图分类号] [文献标识码]A [文章编号]2096-8388(2022)06-0621-07
DOI:.2096-
Effectoftangtongyindrug-containingserumonproliferationofHBZY-1
cellsinhighglucoseenvironmentanditsmechanism
FUHongying1,PANYanling1,2,CHENYuru1,CHENHongming1
(,ClinicalMedicalCollegeofGuizhou
MedicalUniversity,Guiyang550000,Guizhou,China;,
theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,Guizhou,China)
[Abstract]Objective Toanalyzetheeffectoftangtongyindrug-containingserumserumonthe
proliferationofratglomerularmesangial(HBZY-1)cellsinhighglucoseenvironmentanditspossible
ThirtySPFmaleSDratswererandomlydividedintoblankserumgroupand
tangtongyindrug--containinggroupwerefedwith
tangtongyinbyintragastricadministration,andratsinblankserumgroupweregivenequalvolume
-1cellsculturedfrom3rdto15thgenerationweredividedintonormal
glucose+blankserumgroup,highglucose+blankserumgroupandhighglucose+tangtongyin
[基金项目]国家自然科学基金(82060837);贵州医科大学附属医院2020年国家自然科学基金培育项目(gy5ynsfc〔2020〕-3)
贵州医科大学2019级硕士研究生
通信作者E-mail:******@
621
书
贵州医科大学学报 47卷
drug-,thecellproliferationofeachgroupwas
detectedbyCCK-8method,theexpressionofTGF-β1,Smad2,andSmad3mRNAwasdetectedby
real-timefluorescencequantitativePCR,andtheexpressionofTGF-β1,p-Smad2/Smad2,andp-
Smad3/ Comparedwiththenormal
glucose+blankserumgroup,cellsinthehighglucose+blankserumgroupproliferated
significantly,andtheexpressionofTGF-β1,Smad2,andSmad3mRNAandtheexpressionofTGF-
β1,p-Smad2/Smad2,andp-Smad3/Smad3proteinwerealsoincreased(P<).Comparedwith
thehighglucose+blankserumgroup,thecellproliferationwasinhibited,andtheexpressionof
TTGF-β1,Smad2,andSmad3mRNAandtheproteinexpressionofTGF-β1,p-Smad2/Smad2,and
p-Smad3/Smad3weredecreasedinthehighglucose+tangtongyingroup(P<).Conclusion
Tangtongyincaninhibittheproliferationofhbzy-1cellsinhighglucosestate,anditsmechanismmay
berelatedtotheinhibitionofTGF-β1/Smadsignalingpathway.
[Keywords]glomerularmesangialcells;cellproliferation;diabetickidneydisease(DKD);rat;
TGF-β1/Smadsignalpathway;highglucoseenvironment;tangtongyin-containingserum
糖尿病(diabeticmellitus,DM)是一种以高血通路的影响,探寻糖通饮体外细胞层面的分子作用
糖为特征的慢性代谢性疾病[1]。根据国际糖尿病机制,完善糖通饮防治DKD的作用机制,为糖通饮
联盟发布的第9版《IDF全球糖尿病概览》显示,预的临床使用提供理论依据。
计到2045年,
人[2]。糖尿病肾病(diabetickidneydisease,DKD)1 材料与方法
患者最主要的病理改变之一是肾纤维化[3-4]。肾
小球系膜细胞是肾小球的固有细胞之一, 材料
导致DKD肾纤维化的重要因素[5]。近年来, 实验动物及细胞 30只SPF级SD雄性大
究发现,转化生长因子-β1(transforminggrowthfac-鼠,体质量(180±20)g,购自辽宁长生生物技术股
tor-beta1,TGF-β1)/Smad信号通路被公认为在份有限公司,动物生产许可证号SCXK(辽)2020-
DKD的肾纤维化进程中起着重要作用,DKD发生0001;大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1,购自深圳
发展时,TGF-β1/Smad信号通路被过度激活,进而OtwoBiotech公司。
引起肾小球系膜细胞增殖,细胞外基质(extracellu- 药物 糖通饮颗粒剂,由广东一方制药有
armatrix,ECM)的合成降解失衡,促进肾脏纤维限公司提供,规格21g/袋,组成药物为生地、山药、
化[6-8]。在TGF-β1/Smad信号通路中,TGF-β1被山茱萸、茯苓、泽泻、丹皮、黄芪、丹参、地骨皮、草决
认为是肾小球硬化和肾小管间质纤维化机制中最明。药材质量标准:生地(TS-QM-C094)、山药(TS-
关键的细胞因子,Smad2和Smad3则是促进TGF-QM-C347)、山茱萸(TS-QM-C350)、茯苓(TS-QM-
β1介导组织纤维化的两个主要下游调节因C117)、泽泻(TS-QM-C460)、丹皮(TS-QM-C-275)、
子[9-11],因此,研究寻找抑制肾小球系膜细胞增殖黄芪(TS-QM-0179)、丹参(TS-QM-C085)、地骨皮
以及TGF-β1/Smad信号通路过度激活的有效药(TS-QM-C093)、草决明(TS-QM-C215)。
物,对DKD的防治具有重要意义。 试剂 胰酶细胞消化液、DMEM正常糖培
动物及临床实验研究发现,临床经验方糖通饮可抑养基、Opti-MEMReducedSerumMedium由GIBCO
制DKD大鼠肾组织TGF-β1/Smad信号通路的激公司提供,青链霉素双抗由HyClone公司提供,
活;改善早期DKD患者尿微量白蛋白、空腹血糖、Westernblot一抗稀释液、RIPA裂解液、脱脂奶粉
血脂及糖化血红蛋白,从而达到预防肾纤维化、延由Solarbio公司提供,特级胎牛血清(南美)由BI
缓DKD发展为终末期肾病的效果[12-13]。本研究公司提供,RNA提取用Trizol购自thermo公司,细
拟观察在高糖环境下,糖通饮含药血清对大鼠肾小胞RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒购自上
球系膜细胞(HBZY-1)增殖和TGF-β1/Smad信号海翊圣生物科技有限公司,PVDF膜和Whatman滤
622
6期伏红颖等 糖通饮含药血清对高糖环境下HBZY-1细胞增殖的影响及其作用机制
纸购自Millipore公司,GAPDH抗体购自protein- CCK-8法检测细胞的增殖情况 系膜细胞
tech公司,TGF-β1一抗、Smad3一抗、Smad2一抗以3×104/mL接种于96孔板中,每孔体积100μL,
购自abcam公司,Phospho-Smad2一抗、Phospho-细胞贴壁后将培养基换成含有相应大鼠血清的培
Smad3一抗均购自CellSignalingTechnology公司,养基,将培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培
山羊抗兔IgG-HRP二抗购自proteintech公司。养48h后,%的CCK-8溶液10μL,
研究方法继续培养4h后,在摇床上温柔的摇匀,用酶标仪
细胞的传代和培养 大鼠肾小球系膜检测各孔在波长450nm处吸光值,每组同时设置
HBZY-1细胞鉴定后,选取第3~15代细胞培养在调零孔和对照孔。计算细胞增殖率,细胞增殖率=
含有10%FBS的DMEM正常糖培养基中,置于[(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光
37℃、5%CO2的培养箱,待细胞融合度达80%~值-空白组吸光值)]×100%。
90%时吸去瓶内培养基,PBS洗涤细胞3次, 实时荧光定量PCR法检测TGF-β1、
废液,%胰蛋白酶(1mL)消化收集细胞Smad2、Smad3的mRNA表达 收集培养的各组细
1min,10%培养基2mL终止消化反应,用移液枪胞,按Trizol说明书提取细胞总RNA,根据上海翊
轻轻吹打细胞悬液,混匀后吸入新的培养瓶,置于圣公司反转录试剂盒操作说明书将RNA逆转录为
37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。cDNA,按荧光定量PCR试剂盒检测TGF-β1、
含药血清的制备 30只SPF级雄性SD大Smad2、Smad3mRNA表达,以GAPDH作为内参,
鼠,随机分为空白对照组和糖通饮含药血清组,每引物见表1,2-ΔΔCT计算各组基因相对表达量,进行
组15只;灌胃前将糖通饮颗粒剂按1g/L的生药统计分析。
浓度充分溶于双蒸水中,/(kg·d)灌胃表1 引物序列及目的片段大小
糖通饮含药血清组大鼠(按照人体- Primersequenceandtargetfragmentsize
积比值换算),空白对照组给予等体积的双蒸水,基因引物序列(5′-3′)目的片段/bp
连续给药7d。末次给药1h后,经股动脉取血,血TGF-β1F-5′-GCCTGCAGAGATTCAAGTCAAC-3′305
样静置2h,4℃,3000r/min离心20min,分离血R-5′-GAAGGGTCGGTTCATGTCATG-3′
清,60℃水浴30min灭活补体,过滤除菌,-80℃Smad2F-5′-ACTGTCTCCTACCACTCTCTCC-3′163
冻存。R-5′-AAAGCCGTCTACAGTGAGTGAG-3′
含大鼠血清的DMEM培养基配制 以高Smad3F-5′-AAGAAGCTCAAGAAGACGGGG-3′226
糖+10%糖通饮含药血清组培养基(30mmol/L葡R-5′-TGTTGAAGGCGAACTCACAGA-3′
萄糖,50mL)配制方法为例:-5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′92
R-5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′
糖充分溶于正常糖培养液45mL中,在超净工作
台用过滤器过滤后,加入糖通饮含药血清5mL, Westernblot法检测TGF-β1、p-Smad2/
倒混匀后分装入5mL离心管中,充分混匀后于-Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达 将培养结束的
20℃或4℃储存。六孔板拿出,吸去培养基,用含PMSF的裂解液提
实验分组 收集到的大鼠肾小球系膜HBZY-取上清液,BCA蛋白定量分析;4∶1加蛋白上样缓
1细胞共分为正常糖+空白血清组(,100℃变性10min。SDS-PAGE蛋白凝胶电
萄糖+10%空白对照组大鼠血清)、高糖+空白血泳:制胶、上样、电泳、PVDF转膜,5%脱脂牛奶室
清组(30mmol/L葡萄糖+10%空白对照组大鼠血温封闭2h,一抗TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、
清)以及高糖+糖通饮含药血清组(30mmol/L葡p-Smad34℃孵育过夜;二抗常温下孵育1h,超敏
萄糖+10%糖通饮含药血清组大鼠血清)[14],共发光液显色,凝胶成像分析系统检测蛋白条带,软
3组。件ImageJ计算灰度值。
糖通饮含药血清干预 选取第3~ 统计学分析
鼠肾小球系膜HBZY-1细胞,以2×105个/,计量资料
度接种于6孔板内,每孔细胞悬液2mL,待细胞贴以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素
壁后,将培养基换成含有相应大鼠血清的DMEMANOVA方差分析,以P<
培养基。学意义。
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贵州医科大学学报 47卷
2 结果
HBZY-1细胞的增殖情况
与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清
组大鼠肾小球系膜HBZY-1细胞增殖率升高,差异
有统计学意义(P<);与高糖+空白血清组相
比较,高糖+糖通饮含药血清组细胞增殖率降低,
差异具有统计学意义(P<)。见图1。
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
空白血清组比较,P<。
图2 各组HBZY-1细胞TGF-β1mRNA表达(n=3)
ExpressionofTGF-β1mRNAinHBZY-1
cellsineachgroup(n=3)
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
空白血清组比较,P<。
图1 各组HBZY-1细胞的增殖情况(n=3)
ProliferationofHBZY-1cellsineachgroup(n=3)
HBZY-1细胞TGF-β1mRNA表达
与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清
组TGF-β1mRNA表达增多,差异具有统计学意义
(P<);与高糖+空白血清组相比,高糖+糖
通饮含药血清组细胞TGF-β1mRNA表达减少,差
异具有统计学意义(P<)。见图2。注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
HBZY-1细胞Smad2mRNA表达空白血清组比较,P<。
图3 各组HBZY-1细胞Smad2mRNA表达(n=3)
与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清
ExpressionofSmad2mRNAinHBZY-1
组Smad2mRNA表达增多,差异具有统计学意义
cellsineachgroup(n=3)
(P<);与高糖+空白血清组相比,高糖+糖
通饮含药血清组细胞Smad2mRNA表达减少,差异具有统计学意义(P<)。见图4。
异具有统计学意义(P<)。见图3。 HBZY-1细胞TGF-β1蛋白表达
HBZY-1细胞Smad3mRNA表达与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清
与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清组细胞TGF-β1蛋白表达增加,差异具有统计学意
组Smad3mRNA表达增多,差异具有统计学意义义(P<);与高糖+空白血清组相比,高糖+
(P<);与高糖+空白血清组相比,高糖+糖糖通饮含药血清组细胞TGF-β1蛋白表达降低,差
通饮含药血清组细胞Smad3mRNA表达减少,差异具有统计学意义(P<)。见图5。
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6期伏红颖等 糖通饮含药血清对高糖环境下HBZY-1细胞增殖的影响及其作用机制
HBZY-1细胞p-Smad2/Smad2蛋白表达
与正常糖+空白血清组相比,高糖+空白血清
组细胞p-Smad2/Smad2蛋白表达增加,差异具有
统计学意义(P<);与高糖+空白血清组相
比,高糖+糖通饮含药血清组细胞p-Smad2/Smad2
蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<)。
见图6。
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
空白血清组比较,P<。
图4 各组HBZY-1细胞Smad3mRNA表达(n=3)
ExpressionofSmad3mRNAinHBZY-1
cellsineachgroup(n=3)
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
空白血清组比较,P<。
图6 各组细胞p-Smad2/Smad2蛋白表达(n=3)
Expressionofp-Smad2/Smad2proteins
inHBZY-1cellsineachgroup(n=3)
HBZY-1细胞p-Smad3/Smad3蛋白表达
与正常糖+空白血清组比较,高糖+空白血清
组细胞p-Smad3/Smad3蛋白表达增加,差异具有
统计学意义(P<);与高糖+空白血清组相
比,高糖+糖通饮含药血清组细胞p-Smad3/Smad3
蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<)。
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
空白血清组比较,P<。见图7。
图5 各组HBZY-1细胞TGF-β1蛋白表达(n=3)
ExpressionofTGF-β1proteinsinHBZY-1
cellsineachgroup(n=3)
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贵州医科大学学报 47卷
进DKD的发生发展[18-19]。Smads蛋白是介导
TGF-β信号转导的蛋白,分为受体激酶、通用型和
抑制型三种。Smad2和Smad3属于受体激酶,是促
进TGF-β1介导组织纤维化的2个主要下游调节
因子,当DKD发生发展时,TGF-β1先与Ⅱ型受体
(TβRⅡ)结合,磷酸化Ⅰ型受体(TβRI),进一步激
活下游Smad3信号,促进Smad复合物产生,入核
并干扰相关基因的表达,比如ECM成分纤连蛋白
(FN1)和胶原蛋白等,从而进一步加重DKD肾纤
维化程度[20]。本实验结果发现,HBZY-1细胞在高
糖刺激下明显增殖,且细胞中TGF-β1、Smad2、
Smad3mRNA表达升高,TGF-β1、p-Smad2/Smad2、
p-Smad3/Smad3蛋白表达升高,提示TGF-β1/Smad
通路的激活参与了高糖环境对HBZY-1细胞的
损害。
中医学中无DKD这一病名,但按其临床表现
当隶属于消渴病并虚劳、肾劳、水肿等范畴,消渴病
的基本病机为阴虚燥热,发展日久则气阴两虚、瘀
血内生,且阴虚日久、阴损及阳、阴阳俱虚,导致脏
腑功能受损而致浊毒内停[21],最终形成DKD气阴
两虚为本、痰瘀浊毒阻络为标的基本病机特点。有
研究指出,根据DKD这一基本病机特点创制了中
注:(1)与正常糖+空白血清组比较,P<;(2)与高糖+
药复方糖通饮,该方是在六味地黄丸的基础上易熟
空白血清组比较,P<。
地黄为生地黄,伍入黄芪、丹参、地骨皮、草决明而
图7 各组HBZY-1细胞p-Smad3/Smad3
[22]
蛋白表达(n=3)成。本研究所采用的糖通饮是以黄芪为君,生
Expressionofp-Smad3/Smad3proteins地黄、山药、山茱萸为臣,培补肝肾、调养气阴以固
inHBZY-1cellsineachgroup(n=3)本虚;佐以茯苓、牡丹皮、泽泻、丹参、地骨皮、草决
明,除标实之痰浊,通肾络之瘀阻;诸药合用,标本
兼治,益气养阴保肾,活血化瘀通络。现代药理学
3 讨论研究表明,黄芪中的黄芪甲甙及黄芪多糖两种主要
活性成分,具有降低血糖、减轻蛋白尿以及保护肾
研究表明,系膜细胞增殖在DKD的发生发展脏功能的作用[23];丹参中的酚酸类和二萜醌类成
中起着重要作用,过度增殖的系膜细胞可通过多种分可以抑制肾纤维化和炎症,减轻临床患者的尿蛋
途径影响肾脏功能且与肾纤维化密切相关[15]。白排泄率[24];地骨皮、草决明可降糖降脂[25]。糖通
TGF-β1/Smad作为DKD发生发展最主要的信号饮已在临床使用多年,并且取得了较为肯定的疗
通路,它的激活对DKD肾间质纤维化起着重要的效[26],但其作用机制仍不十分明确。本研究结果
促进作用[16]。该通路中的TGF-β1是DKD发病过显示,与高糖+空白血清组比较,高糖+糖通饮含
程的中心环节,处于DKD相关生长因子网络中心药血清组细胞增殖被抑制,HBZY-1细胞中TGF-
地位[17],在DKD发生发展过程中,TGF-β1通过刺β1、Smad2、Smad3mRNA表达降低,TGF-β1、p-
激系膜细胞活化增殖,分泌大量的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表达均有不同
原及纤连蛋白等细胞外基质(ECM)成分,导致程度的降低,说明该方可缓解高糖环境对HBZY-1
ECM的堆积。此外,TGF-β1的过度表达,还可刺细胞的损害,并抑制TGF-β1/Smad通路的激活。
激金属蛋白抑制剂产生,抑制胶原酶的合成,从而综上,本实验首次采用中药血清药理学方法,
使ECM降解减少,有利于ECM在肾脏的积聚,促从细胞层面证实了糖通饮可以抑制高糖状态下大
626
6期伏红颖等 糖通饮含药血清对高糖环境下HBZY-1细胞增殖的影响及其作用机制
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