硝酸纤维素膜NC膜.docx

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名目概念
NC膜的生产原理
NC膜的供给商及现状
NC膜的选择膜的质控方式
膜的深入探讨和应用技巧
NC膜的应用举例概念
NC膜的生产原理
NC膜的供给商及现状
NC膜的选择膜的质控方式
膜的深入探讨和应用技巧
NC膜的应用举例
概念
***纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜),在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反响的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。
NC膜的生产原理
匀浆配比
购置回来的原料***纤维素粒子是一种格外普遍的有机化学物,溶解形成混浆,在该浆体内,
通过参加肯定比例的试剂来调整最终形成的膜的性质, 一般主要包含外表活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解的一个缓冲体系内。不同的厂家参加的溶液配方不一样,导致了产品的差异。
滚筒铺膜
配好的匀浆通过滚筒,形成了一张薄膜,平摊在格外光滑的平面载体上。过程与造纸格外相像。
成型
当匀浆内的成型剂开头挥发,膜逐步枯燥成型。同时在这个过程中由于温度比较高,有些厂家在这个过程实行了在密闭腔体内成型,同时补充配方溶液的形式,来避开一些有效成分的蒸发。
切割
通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品,宽度的大小直接和滚筒的大小相关,滚
筒越大生产越便利, 25mm或18mm〔或20mm〕宽的膜,而长度上,成品卷膜和宽膜的长度是一样的 .理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度,但这样会造成原料的铺张和人力本钱的增加,后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中,综
合用料本钱和生产便利性根本确定了上面说的宽度,以次为标准。
从生产过程,我们可以得知,NC膜本身已经添加了外表活性剂来改善亲水力量,而且已经存在有肯定的缓冲系统〔虽然对纸条测试影响不会很大〕。
NC膜的供给商及现状
现在有销售的NC膜品牌型号如下:
PALL(美国)
MILLIPORE〔美国〕,M135〔有背衬/无背衬两种〕M180〔有背衬/无背衬两种〕WHATMAN andSS,Puraband impuraband
SARTORIUS〔德国〕,CN140
伊能〔国产〕,8um 6umMDI〔印度〕,8um6um
说到这些供给商,,这点全部的膜公司都成认。 millipore,SARTORIUS和whatman都是后代,由于SS在市场竞争的过程中经营方式落后,最终被whatman收购。就产品质量来说SS的AE99和AE98是格外优良的。
而MDI是近年才消灭的一个膜公司,可能与印度胶体金试纸生产行业的快速进展亲热相关,其全部的产品都是在印度生产,经营者为父子两人,父亲负责技术,儿子进展经营。
国产膜伊能主要特点本钱较低,性能与一些进口膜很接近,经过一些有针对性的优化后可以用在HCG产品的生产。但不是全部的工厂都能购轻易的完成这个优化工作。膜的国产化是一个趋势,但进口厂家要实现国产化还面临很大的问题,其中厂房设备的搬迁就是一个格外大的问题。
几家供给商的国内联络人和技术支持分别是
PALL〔美国〕,MrXiaoliang Tang, Dong WangMILLIPORE〔美国〕,MrsYang,harryWHATMAN andSS,Clark,kevin
SARTORIUS〔德国〕,MrXu,Iric伊能〔国产〕,connie,MrYangMDI〔印度〕,Ashawant Gupta
销售模式都是直销式,少量购置需通过代理商购置。价格上PALL、MILLIPORE与WHATMAN相当,SARTORIUS廉价一些,国产膜更廉价一些。印度膜和SARTORIUS价格一样。在科研市场,PALL、MILLIPORE使用最多。生产客户中,MILLIPORE,HATMAN,SARTORIUS占有量相当,
伊能现在也开头有一些工厂客户了,MDI量最小投诉也最多。
NC膜的选择
以上谈了该行业的一些进呈现状,那么我们大致了解后,回到最关心的问题,如何选择膜?经常会遇到的问题是,我是做**工程的,我该选择那类膜?
这里涉及到一个膜的分类标准问题,一个供给商可能供给这个膜是 8um,但另一个供给商告知你膜是135s的。这之间的区分与联系是什么?
um指的是膜孔径,而从上面膜的生产过程,我们可以看出,膜的孔径实际上是没有方法界定的。由于枯燥成型等过程的非确定均一,膜的孔径也是非均一的 .,每4cm膜,水的层析时间是***,成为了一个通用的比较标准 .以下我们将承受s单位来进展沟通。
换算状况大致为:8um=135s;6um=180s
不同秒数的膜对反响有什么影响呢?
首先,我们分析一下液体在膜上的运动过程。一张长度为 4cm的膜,每隔1cm做一个标记,。而两张不
同秒数的膜〔例如135s,180s〕,可以考虑用色素水溶液,格外明显。
那么从这个试验可以看出,在通过同一 T线喷点位置时,金溶液通过的速度是快速膜 >慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反响时间也就越短,读数快,那么灵敏度也就越低。反之,
反响时间长,读数慢,也就灵敏度高。同时还有一个问题是,反响时间越长,发生非特异性结合的
可能性就越大,所以过长时间的反响不肯定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间 /
反响灵敏度/非特异性结合的均衡。
其实我们并没有那么多项选择择。经过使用实践,各供给商一般都只供给两个型号,就是 135s和180s。虽然看到有些厂家的产品名目上型号种类繁多,但这两个型号的定货量就占了 95%以上,其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺当。 135s一般用在双抗体夹心法,,先选择其中的一个型号, 然后比较不同供给商同一个型号的差异,由于前面说
的添加配方与你的试验条件协作的不同,这个差异可能大也可能小。具体要依据试验结果来确定最
后的选择。我个人不建议地毯式的测试不同规格 /不同厂家的膜,这样本钱高,成功的几率也小。
膜的质控方式
本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说,厂家的质控标准已经完全能满足你的要求,而不需要自己再做相关的质控。
膜的质控虽属于原辅料QC职能,但由于其专业性强,一般都由小样调试人员来执行。膜入原料库后需要进展如下检验工作:
查收COA
在购置时,供给商会随产品为每个lot的膜供给一张纸质的出厂质量证书, 该证书被称为COA。假设你已经购置某一批次的膜, 而没有索取相应的证书,假设有需要可供给批号向厂家要求补发。其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上 COA的****惯。
COA一般只供给应大客户, 对小客户是没有意义的。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的排列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。
检查物理性能
膜的物理性能主要是2个参数,膜厚度和宽度。长度不需要检测。使用中可以关注长度上是否有断面重接现象,断面多费料则多,少数发生。厚度,由螺旋测微尺,选择几个测量点检测后算
平均。膜生产的必测参数。主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的集中性能,点出来的 C/T
线宽窄不一,另外也影响爬速。宽度,一般直尺测量。物理性能一般都不会有什么大问题。到底检测标准客观,易把握。没有条件执行的厂家可省略。
跑水性能
样本承受含有有色食用色素的水溶液,目的是简洁观测,需制作一个简易支架。
操作:注入足够溶液到下部槽内,将不同批次膜每隔 1cm做一次标记〔总长大于4cm〕并放到倾斜支架,整个支架下端放入溶液槽,膜开头吸液,计时。记录每个标记处的通过时刻,并与比照
组比较。跑板时,理论上溶液呈水平线形式上吸,观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。
点样测试
C/T线出线时间,其他试验条件一样状况下,记录和比较 C/T线消灭时间是否与比照有差异。灵敏度,比较不同样本浓度状况下,T线的变化是否和比照组同。一般每批次膜取前端一段用
来测试即可。由于制造过程的不均一性, 不同批号的灵敏度会有肯定差异,当大批量使用时,这种差异影响是格外大的,那么就要依据灵敏度表现将不同批号的膜进展分类。在膜的 STOCK中要能够轻易的区分出来。当进入后期生产调用时,就能依据这些分类,依据订单要求取用不同批号的膜,
或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。
关于膜的批内差。批内差是确定存在的,只是差距大小的问题,依据一般的测试条件是很困难获得具体的数值,由于你不行能对每一卷膜的每一段都做具体的测试。减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。前面说过膜的生产方式,生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面,要通过截面
裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间局部,,膜的均匀性越好,边缘局部则相对要差,就造成了批内差。一般可以通过COA获得具体位置信息,例如MILLIPORE就在切割后用字母A,B,C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。
假设是试用某个型号的膜小样,还需要在以上检测后参加膜加速老化试验,包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验,具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。
膜的深入探讨和应用技巧
从本节开头,我们开头对膜进展深入争辩和谈一些应用技巧。
蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理, 的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等,准确的结合原理并不明确,主要靠假说来支撑。主要有两种假说:
首先两者靠静电作用力结合,然后靠 H键和疏水作用来维持长时间结合。
首先两者靠疏水作用结合,然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说,都说明其结合过程分为两步,首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性,导致在这方面的工作格外依靠实践阅历。
膜对结合的影响
膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜,但是请留意这只仅仅限于同一厂家的产品,假设是不同厂家的产品,这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系,已在上文描述。随着膜孔
径减小,膜的实际可用外表积递增,膜结合蛋白的量也递增 .估量外表积的参数为外表积比率〔实际可用外表积与所用膜平面积的比率〕。
另外,膜孔径越小,层析速度也越小,那么金标复合物通过 T线的时间也就越长,反响也就越充分。
综合以上两点,结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的时机,,找到适宜的平衡点。
不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点:
1> 生产膜时,使用的聚合物和外表活性剂的来源,类型,数量不同。同理,在膜处理中这两类
物质一般会对性能产生较大影响。 2> 处理过程不同。
生物原料,缓冲溶液的试剂和配方
生物原料,作为CT线的生物原料使用状况各异,所以这里只做略述。
首先,单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体,主要时由于多克隆抗体有很多不同的外表位点,而各位点与膜的最正确结合条件都有微小的差异,毫无疑问就增加了优化难度。其次,分子量越大,蛋白越难结合到固相材料上。
缓冲液
大家最关心的可能就是期望获得一共性能优良的配方,包括缓冲液,封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法供给应你一个万用配方清单。由于不同的反响体系需要不同的配方来支持, 而不同机构的反响体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家,我在下面涉及到配方的问题上,仅供给思路,具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是:PBS〔或其他缓冲体系〕+作用物质〔针对某一特定问题〕+,个人意见为配方原则为宜简不宜繁,依据自己的需要添加作用物质,原来的很多需要添加的作用物质,由于膜制造技术的改进已经不再需要。
PBS PH7-,该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。作用物质的状况大致排列如下:
少量NACL,削减信号强度,消假阳。
有机醇〔甲醇,异丙醇等〕,润湿膜,削减膜带有的静电,利于结合包被。个人不推举,因制膜工艺改进。
外表活性剂〔TW20,TX100〕,增加亲水力,可避开线条中空现象,也可增色。糖,保护剂,减缓老化速度,也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置,可以消假阳。
点样环境
环境湿度对点膜过程格外重要。最正确湿度一般在45-65%。湿度过低,膜上简洁聚拢静电荷,点膜简洁消灭散点,导致测试会消灭疏水斑。湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜简洁引起CT线变宽甚至集中。为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
点样仪器与膜面状况的关系
目前有两种点样方式,划膜式和非接触点膜式 .非接触点膜式优于划膜式,进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜外表,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其外表留下印痕 .进口的划膜机由于使用的材料和把握系统较好,所以留下的划痕较轻,而国产仪器较差,留下的划痕
也就比较严峻。划痕简洁对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性。 同时简洁消灭跑板时在T
线位置消灭假设有假设无一条细线〔鬼线〕,而跑板完毕后鬼线消逝的惊异现象。
膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm〔or20mm〕和25mm两种,分别使用在做测试条和做测试板上。然而,不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移,金标复合物通过 T线位置时速度变慢,反响时间增加,灵敏度上升。反之灵敏度降低。这个方法可以用来转变灵敏度和消退假阳性。
溶液在膜上的集中
溶液在膜上的点样量一般状况下为 1ml/cm。溶液在膜上的集中是趋向两端的,喷点上去的是均匀的抗体溶液,但当枯燥时线条边缘的枯燥速度高于中间,中间的抗体会不断向两边集中,所以干
燥后抗体是向线条的两端聚拢的。一般状况下不影响你的试验。假设你觉察线条消灭两端红,中间淡的现象,就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
点膜前后的封闭作用
从供给商处购置回的膜根本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用 .然而我们还是经常会遇到关于封闭的争辩。其实封闭不象大家认为的那样,一封闭什么问题都解决了 .老问题走了问题又来了,而且更麻烦,我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。缘由为厂家在生产
膜时候,各种配方是混合参加原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内,必定扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了很多问题,也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题,其实可以通过其他方法来解决,封闭必定是下测。
我经常使用的封闭手法有两种:流淌封闭,将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭,将作
用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用 BIODOT的AIRJET喷头,可以将不合格的半成品大板重复活。只要是将封闭做在了膜上,就必定会对产品的稳定性造成影响,具体的影
响程度要通过稳定性测试来评判。
膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理,有个理论支持,不过争议比较大。理论认为:膜的老化是由于膜上的水分蒸发,使膜变得疏水,带电荷并变脆。储存膜一般要求是避
光,密封,过干或过湿都不利。在这种保存条件下,一般可以放置两年。但是假设膜上做了封闭处理,就要依据具体试验状况来推断了。有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定前方可进入调试生产。
***纤维素膜NC膜规格:15X20cm
孔径:
保存:5-15℃密封保存,保质期一年
产品简介:本品外观洁白,膜正面呈光泽,与水接触应马上浸润,不能马上浸润老者视为失活,
不能点样,膜面有花斑或有粉性构造皆视为次品。用于转移电泳,宜选孔经 ,以保证膜的强度,并削减穿透损失,硝纤膜过份枯燥时脆 ,湿时有弹性,操作时室内应保持中常温度,避开过份枯燥,防止发脆,本品静电吸附膜的亲水性好,渗滤时间适中,蛋白吸附力强,转膜的蛋白集中
而不集中,显色的灵敏度和特异性高,背景低。
NC膜的应用举例

杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用,先将待测核酸结合到肯定的固相支持物上,再与液相中的标记探针进展杂交。固相支持物常用***纤维素膜。
固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个根本过程:第一,通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上;其次,用标记探针与支持物上的核酸片段进展杂交;第三,杂交信号的检测。
用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进展检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中,细胞固定在载玻片上,以固定的细胞代替纯化的核酸,然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里,探针进入组织细胞与靶分子杂交,而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进展原位杂交,以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性,在临床应用上有独特的意义。下面以放射性标记探针与固定在 NC膜上的核酸进展杂交为例,杂交反响操作如下:
①配制所需试剂
SSC溶液(20×):3mol/L NaCl,。
Denhardt’s溶液(50×):聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷***5g,牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
预杂交液:6×SSC,5×Denhardt’s 溶液,%SDS,100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA。
②将含靶核酸的NC膜漂移于6×SSC液面,使其由下至上完全潮湿,并连续浸泡 2分钟。
③将潮湿NC膜装入塑料袋中,,尽可能挤出气泡,将袋封口,置68℃水浴1-2小时或过夜。
④将双链探针做变性处理使成单链,即于 100℃加热5分钟,然后马上置冰浴使骤冷。
⑤从水浴中取出杂交袋,剪去一角,将单链探针参加,尽可能将袋内空气挤出去,重封口,并将杂交袋装入另一个干净的袋内,封闭,以防放射性污染。
⑥将杂交袋浸入68℃水浴,温育8-16小时。
⑦取出杂交袋,剪开,取出滤膜快速浸泡于大量 2×%SDS中,室温振荡5分钟,勿使滤膜枯燥。
⑧将NC膜移入盛有大量2×%SDS溶液的容器中,室温漂洗15分钟。
⑨×%SDS溶液的容器中,37℃漂洗30分钟至1小时。
⑩×%SDS溶液的容器中,68℃漂洗30分钟至1小时。
⑾取出滤膜,×SSC室温稍稍漂洗,然后置滤纸上吸去大局部液体,待做杂交信号的检
测。