文档介绍：2015年H7讲课
H7血凝、血凝抑制试验
一、注意事项:
1、建议使用96孔90°V型板进行试验,通过反复试验证明:90°V 型板相对于110°板及130°板来讲,具有红细胞沉降速度快,产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。
2、使用圆底离心管,因尖底离心管中的话,离心后,离心管底部红细胞不易与加入的生理盐水混匀,易沉积在管底部,达不到洗脱干净的目的。经1500~2500r/min,5~10min,上下缓慢颠倒(切忌用力过大使红细胞破裂),使其充分混匀,再离心弃去上清液,反复几次直至上清液清亮透明为止。制备好的红细胞液若放置后上清液变红,说明有溶血,不可再使用。
3、配制好的抗原稀释液应在2h内用完。
4、每次做试验前,必须重新检测禽流感抗原的血凝效价,以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确,从而导致试验结果不准确。二、1%红细胞配制
-3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。采血的前提条件是要在一次性注射器中加入抗凝剂,如肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等(现在用的人用含抗凝剂的采血管)。
2. 用生理盐水洗涤3次,1500r,离心5-10分钟。
3. 吸弃上清液,将沉积的红细胞配成1%红细胞悬液。
4. 4±2℃储存,备用。
三、血凝试验
1、定义:某些病毒或病毒的血凝素,能选择性地使某种或几种动物的红细胞发生凝集,这种凝集红细胞的现象称为血凝(HA) 2、原理:病毒颗粒或血凝素与RBC表面相应受体结合,引起RBC凝集,用以测定病毒的含量。
3、实验步骤:(针对单独某孔而言,75ul体系)
第一步:在反应板中每孔加25微升生理盐水。
第二步:1-3每孔加25微升抗原,依次作25微升倍比稀释至第12孔。第三步:每孔加25微升生理盐水。
第四步: 每孔加25微升1%鸡红细胞。将反应板在振荡器上震荡混匀,室温静置40分钟,当对照孔的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。
4、结果判定:将反应版倾斜成45°,沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞平铺孔底,凝集呈均匀薄层倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集。
能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数称为该抗原的血凝效价,既沉淀前孔为该抗原的效价。
5、根据HA试验测定的效价,计算配置4单位抗原。例如,HA效价为1:256,则4单位抗原的稀释倍数既256÷4。则抗原与稀释液的配比为1:64。四、血凝抑制试验(HI)
1、定义:当病毒的悬液中先加入特异性抗体,且这种抗体的量足以
抑制病毒颗粒或其血凝素,则