文档介绍：chip实验流程
操作要点
二、技术总结
(一)、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75%-80%比较好。
(二)、关于抗体!
抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体,即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中, 很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。
一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。
(三)、关于交联与超声破碎!
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片
段。
交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下 15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器, 那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。
(四)、关于操作
希望尽可能的保持低温(4度)。
沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
(五)、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在
EP管口封上封口膜。
(六)、关于DN***段的回收
需要注意的是:样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。
小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。
另外还有一些,一时想不起来。以后慢慢补充吧。
与EMSA相比,优势就是直接研究了体内的情况。EMSA,并不能真实地模拟体内的环境,蛋白分子和核酸分子的浓度也发生变化了,更不用说蛋白分子和核酸分子在细胞内的定位问题。
“所谓的EMSA,其实就是在体外,将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起,然后看它们是否能相互结合。
但是众所周知,体外环境和体内环境是完全不同的。
很有可能在体内,这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题,根