文档介绍：DNA提取方法
DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书
作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11
? Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA
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注意:
1) 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp,还要视样本类型与保存年限而定。
2) 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。
3) 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。
4) 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。
5) 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃,用于操作步骤9)。
操作步骤:
1) 将小片石蜡包埋的组织(小于25mg)放入2ml离心管中(自备)。
2) 加入1200ul的二甲苯,用力涡旋震荡。
3) 最大转速室温(15-25°)离心5分钟。
4) 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。
5) 往沉淀中加1200ul的(96-100%)酒精(目的是洗去剩余二甲苯),轻柔地震荡。
6) 最大转速室温(15-25°)离心5分钟。
7) 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。
8) 重复一次步骤5-7。
9) 37°孵育10-15分钟,孵育过程打开离心管盖,直到酒精蒸发干净。
10) 加入180ul的ATL缓冲液,继续提取组织总DNA中的步骤2。
操作步骤:
1) 用PBS润洗组织样本(小于25mg)两次(目的是去除固定剂)。
2) 去PBS,继续提取组织总DNA中的步骤1.
注意:
1) ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀,如果沉淀,在56°孵育直至沉淀溶解。
2) 在AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量(见瓶身)的(96%-100%)酒精,然后才使用。
3) 打开水浴锅至56℃,用于步骤2。
4) 如果是冻存的样本,拿出来室温预热,避免反复冻融。
操作步骤:
1) 取25mg组织,切成小块,。加入180ul的Buffer ATL。
2) 加入20ul的蛋白酶K。涡旋震荡(5-10S)。56℃孵育直至组织消化完全,一般为1-3小时。偶尔间断的拿出震荡。
3) 涡旋震荡15S,加入200ul的Buffer AL,涡旋充分混匀。加入200ul的(96%-100%)的酒精。涡旋充分混匀。(注:样多时可将AL和酒精预混以节省时间)
4) 转移步骤3中的所有混合液至DNeasy Mini spin离心柱,柱子放在2ml的收集管上(已提供),≧6000g(8000rpm)离心1分钟。弃收集管/液。
5) 将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)加500ul缓冲液AW1,≧6000g(8000rpm)离心1分钟。弃收集管/液。
6) 将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)。加500ul缓冲液AW2,20000g
(14000rpm)离心3分钟。弃收集