MTX压力与表达筛选.doc

文档介绍：MTX压力与表达筛选
MSX加压筛选与MTX加压筛选
分子生物与细胞培养
蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)筛选用的是谷氨酰***合成酶基因(glutaminesynthetase, GS)系统压力;
氨甲喋呤(amethopterin, MTX)筛选用的是二氢叶酸还原酶基因
(dihydrofolatereductase, dhfr)系统压力。
1. CHO细胞表达体系
常用的CHO细胞系有两种:CHO和CHO(dhfr-),CHO(dhfr-)是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一,与其它表达系统相比,它具有许多优点:准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子;表达产物胞外分泌,便于分离纯化;具有重组基因的高效扩增和表达能力;贴壁生长,有较高的耐受剪切力和渗透压能力,可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度,培养体积能达到1000L以上;CHO细胞属于成纤维细胞,很少分泌内源蛋白,利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO细胞,可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生,将bcl-2基因(细胞凋亡抑制基因)导入细胞,bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡,减少细胞特定营养成分的消耗,提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因,可使细胞G1期延长(细胞静止),改造后细胞活力正常,营养成分消耗和代谢
毒物含量有效降低,从而减少细胞凋亡、死亡,外源蛋白表达量提高,产品成本降低。
2. 载体系统
借助真核基因表达调控的理论,可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中,使其方便高效地表达外源基因。目前,已经构建了许多真核表达载体,它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等;CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记:非扩增基因和共扩增基因。
。作为表达载体元件之一,启动子既需强的转录活性,又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用,所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明:在CHO细胞中,CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子,如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子,现在热衷于寻找细胞内源性的启动子,如肽链延长因子基因的启动子(EF-1α)、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响,如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面,其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现,由于在特定的细胞内,
反式作用因子是固定的,不可改变的,因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言,也就是决定于特定的表达载体中的启动子,一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞,各启动子起始转录的效率有很大的差别,因此我们认为在进行外源基因的表达研究中,应考虑选用几种不同的强启动子,才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件,具种、组织特异性,CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。
CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是neo等非扩增基因,它对目的基因的拷贝数没有影响,用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能,也称共扩增基因,如二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase,dhfr),谷氨酰***合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)。外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。dhfr基因扩增系统最常用,当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后,或携带dhfr基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后,可以得到在选择培养基生长的细胞克隆,dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤(Amethopterin,MTX)所抑制,不断提高MTX浓度,绝大多数细胞死亡,但在极少数幸存下来的抗性细胞中,dhfr基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系,结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增,拷贝数可增加几百到几千倍,从而使目的基因高水