文档介绍：乳糖酶基因
生物技术084 张权 20080134404
乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质,还含有免疫球蛋白等抗病因子,易被人体消化吸收,是人类改善营养、增强体质的理想食品。除此之外,在牛乳等制品当中还含有5%左右的乳糖,它是牛奶中主要的碳水化合物,对人体有着重要的作用。主要表现在于乳糖能促进钙质吸收及整理肠道的功效,特别是乳糖被分解后的半乳糖是婴儿脑发育的必需物质,与婴儿大脑的迅速成长有密切关系。然而,人体却不能直接利用乳糖,它必须被乳糖酶分解为单糖的葡萄糖及半乳糖后才能被吸收和利用。据研究发现,世界各国人口都有不同程度的乳糖酶缺乏,东方人乳糖酶缺乏高达85%,从而导致“乳糖不耐症”的发生。
1 材料与方法
材料
菌株与质粒保加利亚德氏乳杆菌购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α由本室保存;pGM T vector购于北京天根生化科技有限公司。
试剂材料细菌培养试剂购于Sigma公司;引物由上海生工合成;LA DNA聚合酶购于自大连宝生物公司;细菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、DNA Ladder购于北京天根生化科技有限公司;T4连接酶、琼脂糖、荧光染料由本室保存。
方法
保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA的提取
用灭菌双蒸水溶解干冻管里的保加利亚德氏乳杆菌,并划平板到MRS固体培养基,37 ℃培养72 h,挑取单个菌落于MRS液体培养基进行增菌(37 ℃摇床)。利用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。
CCGCTCGAGCGGTTATTTTAGTAAAAGGG 3'。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成(下划线碱基分别为BamH I和Xho I酶切位点)。
2 结果与分析
用细菌基因组提取试剂盒提取保加利亚德氏乳杆菌基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,可见到清晰的条带,说明获得高质量的基因组DNA。以该基因组DNA为模板,进行目的基因的PCR扩增,结果可扩出3 024 bp的目的片段。将该目的基因片段进行胶回收纯化后,与pGM T vector进行连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,通过氨苄青霉素筛选,得到4个菌落,4个菌落分别在含有氨苄青霉素的LB液体培养基上增菌培养,采用小量质粒提取试剂盒分别对4管菌液提取质粒。PCR及酶切(如图1)所得质粒,电泳结果发现第3号质粒成功地被三酶切,得到3 024 bp的目的基因,初步证明包含乳糖酶DNA的重组质粒pGM T LacZ构建成功。注:1、2、3、4号为质粒三酶切,5号为500 bp ladder
测序结果及生物信息学分析
,经BLAST同源性分析,与GenBank中登录的序列完全一致。利用生物软件
DNAssist ,其结果推测出肽链具有1 008个氨基酸,该蛋白分子量为114KDa,。利用在线分析软件SOPMA对其蛋白序列进行二级结构分析,结果发现该蛋白氨基酸序列中有20