文档介绍：免疫比浊胶乳颗粒使用
胶乳微球使用中常见问题及解答
问:产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗?
答:产品说明书中给出的胶乳粒径(Diameter)是平均粒径。
问:如何选择胶乳微球的粒径?
答:一般选择粒径小的胶乳微球,则需要的抗体量就多,精密度和线性相对较好,而选择粒径大的胶乳微球性,则所需抗体少,精密度和线性相对较差,相对于小球,大球的灵敏度较好。
问:一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少?
答: 整个测定体系中, 微球的浓度大约在 %左右, 当然这与试剂本身规定的线性有关系。
问:在使用离心方法偶联乳胶微球,一般需要多大的(相对)离心力?
答:需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关,一般 70nm 左右的微球大概 13000g/min 30min 以上,粒径越小所需时间越长,离心力越大。
问:蛋白(抗体)与微球偶联前,是不是微球的活化时间越长,效率越好? 答:羧基微球的活化所需时间很短,一般以 10-20 分钟为宜,长时间的活化反而会降低偶联效率。
问:由于抗体不只是 FC 的氨基酸上有 NH2,是不是表示它可以在任何方向与 EDCA 活化微球偶联呢?如果是这样,是不是会影响抗体与抗原的特异性反应?
答: 事实的确如此,当然由于抗体的空间折叠方式和 FC 端疏水性强,因此偶联反应的绝大多数发生在 Fc 端,对抗体与抗原的结合的影响不大。
问:胶乳微球与抗体偶联后,当时没发现有凝集,但隔夜后发现有凝集,这是什么原因? 如何控制和避免?
答:这种情况一般是偶联效率低的原因。当体系中蛋白不足或是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时, 这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应, 结果是把球又拉在一起了,所以有聚集。可以加一些阻断剂解决,常见的是 BSA,另外,也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢,这是因为微球偶联上蛋白后,相互之间由于携带同种电荷的关系,比较稳定(所以能以胶体样存在),只有当偶尔相互碰撞,遇上彼此的反应基团时才能结合。
3、胶乳的自凝现象如何控制和避免?
答:胶乳自凝与许多因素有关,如高电解质浓度、表面价电荷被中和、或置于某些不利环境如冷冻时。如果电解质浓度升高到某一水平,使得表面的价负荷被掩蔽,胶乳微球之间发生接触,于是便产生凝集,故高离子强度的缓冲溶液不应使用,缓冲溶液的的浓度不要超过 50mM,但有些 CML 胶乳微球具有高电荷密度,则也能够耐受较高的离子强度。对负电荷胶乳微球,不能使用阳电荷的缓冲溶液如 Tris 缓冲溶液,因为能使电荷中和而凝集。在长期贮藏时,悬浮介质的 pH 值应至少保持在比胶乳微球表面基团的 pKa 值高 1-2pH 单位。高浓度的胶乳微球容易促使胶体不稳定, 故胶乳微球的浓度尽量以低浓度为宜,
胶乳微球也不能受冷冻,否则会凝集。
问:抗体偶联至羧基微球后,即时检测效果很好,但置于 37 度 2 天后,抗体活性似乎下降很大,什么原因?
答:这种情况大概是以下情况所致:一、乳胶微球含有表面活性剂,导致胶乳自身出现自凝现象,可以通过显微镜进行观察,如果是胶乳含有活性剂,则在偶联之前进行清洗,保证偶联的胶乳微球没有聚集。二、如果共价结合反应是成功的而抗体活性失活如此迅速,最常见的原因是抗体质量差