文档介绍：细胞学研究方法(完整)
细胞学研究方法
第一章植物染色体制片技术
染色体是细胞核中由DNA、蛋白质和少量RNA组成的易被碱性染料着色的一种丝状或杆状物。也是遗传物质的载体。它可被苏木精、蕃红、结晶紫、吉姆萨、醋酸洋红、地衣红和孚尔根染液等染色。染色体为细胞中最重要的遗传结构。
一、染色体研究技术的发展历史
1888年瓦尔德第一次提出了染色体这一名词。
1910年摩尔根研究果蝇的染色体以来,染色体研究进入了鼎盛时期。
染色体的制作方法和技术始终是一大难关。((The Cell)的1947年版本中, Winiwarter于1912和1921两次定的人的二倍体染色体数是47和48,,单倍体是24,二倍体是48。
上发表?人的染色体数?时,确切是46。而技术上加以突破性改进的两人竟都是搞植物细胞遗传的,而且第一作者, Tjio是一位中国人,名字叫蒋有兴。其发表的照片质量高,它可以使任何未经专门训练的人,不但能数清染色体数目,而且还能给每个染色体找到它的同源伙伴。
Belling(1921)创用的乙酸洋红染色压片法,带动了以研究染色体数目、结构和行为变异与遗传的细胞遗传学和细胞分类学的建立和发展;
Caspersson(1969)首创的染色体分带技术,揭示了染色体的内部结构分化,使对染色体的鉴别和分析更为准确;
同年,Gall等创建的DNA分子原位杂交技术及其以后的不断改进,现已发展可以对单拷贝基因、重复序列以及整个基因组DNA进行准确定性、定位和相对定量的研究。
二、染色体制片技术
国内外通用的制备植物染色体标本的基本方法是压片法和去壁低渗——火焰干燥法。前者为传统技术,后者为70年代末由陈瑞阳创用的新方法。
国外,仍以压片为主;在国内,两种方法都普遍应用,只是个人有偏爱而已。其具体的染色体制片方法如下图:
(基础)
原则:进行细胞分裂的分生器官、组织或单个细胞均可。
根尖:取材方便,分生区集中易判断。
禾本科,-2cm;
双子叶,2-4cm(大),-(小)
裸子植物,2-4cm。
提高分裂指数:同步化处理、变温处理(4-10℃)
茎尖
效果比根尖差,受季节限制,分裂指数低,不适宜用压片法。。幼小花蕾
比茎尖有价值,因处于花粉母细胞减数分裂之前,有用的部分是花药和子房。纵切为二或四进行处理。
愈伤组织
因为老化和分裂的细胞混杂,所以较困难,应以转至新的培养基,愈伤组织大量增殖时取为适宜。
(关键)
1、预处理作用
抑制微管蛋白组装成纺锤丝,但并不抑制前期的细胞分裂,因此,凡进入中期的均
被阻而不能进入后期,积累大量中期分裂相。
可诱导染色体进一步缩短变直,便于染色体分散和使染色体形态更清晰。
2、预处理药物的种类、特点及选择
秋水仙素(colchicine),-%水溶液,易溶于冷水,有剧毒;高温与
照光易失效,现配现用。适用于大、中、小染色体。
对二***苯(p-Dichlorobenzene pDB),常用饱和液,溶于乙醇等有机溶剂,难溶于水。
适用于大、中、小染色体,尤其适合染色体计数;使染色体易于分散较好,但显示缢痕较差。
8-羟基喹啉(8-hydroxyquinoline),。适宜中、小染色体,离
体处理好。优点在于显示缢痕清晰,缺点在于中期分裂相不如其他的多,但总体优于其他药物。
α-溴萘(α-Bromonaphthalene ),饱和液现配最好,适于禾本科及水生植物,活体
处理。100ml加2滴即可。
放线菌***(cycloheximide),适宜早中期染色体供核型分析和G-带研究。20-50ppm,
小染色体用低浓度,大染色体用高浓度
混合处理液
对二***苯+α-溴萘,100ml对二***苯饱和液加1-2滴α-溴萘,对大、中染色体作用迅速。可在短时间内明显缩短。
秋水仙+8-羟基喹啉,等量混合。适做核型。
8-羟基喹啉+放线菌***
3、预处理方法
A、离体处理
即将器官、组织从母体上切割下来处理。
注意事项:
1、材料要少,大≤10,小≤15
2、材料要小,切口邻近分生区,2-3mm
3、经常振摇
4、处理期间,更换预处理液
5、尽量避光处理
6、温度在20℃左右为佳,最忌高温。
B、非离体处理