切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用的制作方法.docx

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专利名称:切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域:
本发明涉及核酸序列的扩增方法,更具体地说,涉及利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法,本发明还涉及了用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。
现有技术状况聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术的发明和普遍使用在生命科学中引起了一场革命。由于该技术能特异性地扩增DNA(基因)的片段,研究者可以获取足够量的DNA片段用于研究或其他目的。与PCR相关的其他技术和方法的不断发明和发展,使PCR的应用范围远远超出了单纯的DNA扩增,而成为现代分子生物学不可或缺的基本工具之一。
PCR技术的原理是通过控制温度的变化来实现DNA扩增的三个步骤变性(如95℃),引物杂交(如58℃),DNA合成(如72℃)。这种温度变化的循环重复(如重复35次),通常由精密而复杂的仪器(PCR仪)来控制。
与此不同的是近年来陆续出现的恒温扩增技术。这些扩增技术应用不同的原理和方法,可在某一特定温度条件下(如37℃),实现核酸(DNA或RNA)的扩增。国际上已有的恒温扩增技术如下链置换扩增术
(StrandDisplacementAmplification,SDA)核酸序列扩增术(NucleicAcidSequenceBasedAmplification,NASBA)转录酶扩增术(TranscriptionMediatedAmplification,TMA)滚环扩增技术(RollingCircleAmplification,RCA)圆环恒温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)解链酶扩增技术(HelicaseDependantAmplification,HAD)此外,一些非特异性的全基因组DNA扩增方法目前已经进入商品化阶段。这些核酸扩增术的对象有些是DNA,还有些是RNA。核酸恒温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在同一温度下进行,而不象PCR反应那样,需要经历几十个温度变化的循环过程。恒温扩增技术的这一特点,使得它们对所需仪器的要求大大简化,反应时间大大缩短,因而具有巨大的实际应用价值。
恒温扩增核酸诊断试剂在国外已发展多年并应用在传染病诊断中。BectonDickinson公司的ProbeTech自动诊断仪,是这个领域内最先进的诊断仪器。它是以SDA恒温扩增技术为基础的。该产品是为高通量的专业诊断大公司而设计的自动化仪器。核酸序列扩增术(NASBA)是目前国际上最成熟的RNA恒温扩增技术,在研究领域广泛应用。但由于该技术未能与较好的检测方法相结合,使其至今未能在临床检验领域达到实用的阶段。
与本发明有关的是链置换扩增术(SDA)在US5270184、US5712124和US5648211中披露。
SDA技术基于以下五个步骤1)特别设计的扩增引物与DNA靶分子特异性杂交。该引物尾部带有一段特异性核酸内切酶的辨认序列;2)DNA聚合酶合成DNA新链。硫基修饰过的“dCTP-thio”在合成过程中被引入到新合成的DNA分子中;3)限制性核酸内切酶辨认特异性DNA序列。由于其中的一股链在合成过程中被修饰,该酶只能在未被修饰的一条链上切开一个缺口,暴露其3’末端;4)DNA聚合酶以切口的3’末端为起点,合成新链,并将“旧链”剥离。被剥离的单股DNA又可以作为模板,与SDA引物结合,指导新一轮的合成。新合成的双股DNA又恢复了半修饰的核酸内切酶位点,核酸内切酶将在此位点重新切开一个缺口,延长、剥离等步骤又重新开始;5)上述各反应步骤在恒温的条件下反复、连续地进行。DNA靶分子呈指数扩增,直到原料耗尽或酶活性丧失。在优化的条件下靶分子可被扩增数十亿倍或更高。
关于链置换扩增技术(SDA)的基本原理参见附
图1。
然而,采用SDA技术存在一些技术上的缺陷,SDA选用的核酸内切酶在正常情况下会切断DNA双链,从而使扩增反应中断。
为使核酸内切酶只切割一条链,SDA反应中必须使用经过化学修饰的单核苷酸,如硫基
dCTP(Thio-dCTP)。。由于硫基dCTP不是DNA聚合酶的天然底物,DNA聚合酶易从模板上脱落,从而使合成较长的产物成为不可能。这就大大地限制了SDA技术的应用。
。同样由于硫基dCTP不是DNA聚合酶的天然底物,致使DNA合成的速率降低。据估计使用硫基dCTP的合成速度只有使用普通dNTP的三十分之一。
。化学修饰的单核苷酸的价格比普通的单核苷酸高许多倍。此外,为克服非天然底物给SDA酶系统(核酸内切酶和DAN聚合酶)带来的困难,SDA反应要求的单核苷酸和酶的浓度大大高于使用普通单核苷酸的DNA合成反应。所有这些都使SDA试剂的价格偏高。
。为使使用非天然底物的反应体系有效,反应条件极为重要。SDA反应体系比较复杂,各成份间的比例均需细心优化。稍微偏离最佳条件,扩增的效果即受明显影响。因此该技术在实际应用中受到一定的限制。
发明内容
概述本发明人利用近几年来新发现的切口酶(NickingEnzyme,限制性核酸内切酶的一种,通过辨认特异DNA序列,在特定位点切断DNA分子双链中的一条链),经长期研究,发展出一种新的恒温扩增技术切口酶核酸恒温扩增术
(NickingEnzymeMediatedAmplification,NEMA)。并与其他相关技术结合,开发出能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域的新的恒温扩增技术产品。
一方面,本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法,其包括以下步骤a)使扩增引物与核酸靶分子杂交,其中所述引物的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;b)用DNA聚合酶合成双链核酸;c)所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;d)DNA聚合酶以切口为起点,以未被切断的另一条核酸链为模板,合成新的双链核酸,并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板,同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点;e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤,以扩增出靶核酸序列。
更具体地说,本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法,其包括以下步骤
1)使双链核酸靶分子变性,使第一正向引物F1,第二正向引物F2与核酸靶分子负链杂交,其中所述第二正向引物F2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;其中所述第二正向引物F2的浓度应高于第一正向引物F1的浓度;使第一反向引物R1,第二反向引物R2与核酸靶分子正链杂交,其中所述第二反向引物R2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;其中所述第二反向引物R2的浓度应高于第一反向引物R1的浓度;此后负链和正链进行相同的扩增步骤;以下仅以负链为例说明扩增过程;
2)DNA聚合酶延长第二正向引物F2;3)DNA聚合酶延长第一正向引物F1,同时剥离第二正向引物F2的延长链(正链);4)第一反向引物R1,第二反向引物R2与步骤3)的正链产物4杂交,DNA聚合酶延长引物R2;5)DNA聚合酶延长第一反向引物R1,同时剥离第二反向引物R2的延长链(负链),本步骤的产物6为两端固定的负链;本步骤的第一反向引物R1的延长产物12为双链DNA;6)第二正向引物F2与产物6负链杂交,DNA聚合酶延长第二正向引物F2;7)恢复DNA双链结构;在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成DNA新链,同时剥离旧链,此步骤产生的产物9为正链和负链DNA的混合物;步骤5)的延长产物12经步骤12)-14)产生产物8,重回步骤8)以后的扩增过程;8)引物杂交,DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2;9)恢复DNA双链结构;重建内切酶辨认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成DNA新链,同时剥离旧链;10)引物杂交,DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2;和11)恢复DNA双链结构;重建内切酶辨认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成
DNA新链,同时剥离旧链;此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物10相同,因此可重新进入步骤9)-步骤11)的反应,重复进行切割、延伸和剥离的步骤,形成循环扩增。
另一方面,。,。较多的辨认序列碱基对能更好地排除非特异性反应,从而使切口酶恒温扩增反应更有效,更特异。
另一方面,本发明提供了利用海藻糖(Trehalose)提高切口酶反应温度的方法,使得原本最佳活性温度为37℃-60℃的反应条件下具备高活性,从而能与最佳活性温度为60-65℃的BstDNA聚合酶配合使用,高效完成切口酶恒温扩增的反应。
另一方面,本发明提供了利用海藻糖提高DNA聚合酶反应温度的方法,使得原本最佳活性温度为37℃的KlenowDNA聚合酶可在50-60℃的反应条件下具备高活性,从而能与最佳活性温度为55-60℃,高效完成切口酶恒温扩增的反应。
另一方面,本发明提供了利用海藻糖提高DNA聚合酶和切口酶反应温度的方法,这使得原本最佳活性温度为37℃的
-60℃的反应条件下具备高活性,在高温条件下以更高效率完成切口酶恒温扩增的反应。
另一方面,本发明提供用于扩增靶核酸序列的试剂盒,其含有切口酶、DNA聚合酶、引物、海藻糖、dNTP和牛血清白蛋白(BSA)。
另一方面,本发明提供上述试剂盒在检测传染病病原体中的用途。
附图简要说明本发明的上述各个方面、特征和其它优点将通过如下详细描述并结合附表和附图更清楚地理解,其中附图1是关于链置换扩增技术(SDA)的基本原理说明;附图2是关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理的简单说明附图3是关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理的详细说明;附图4是关于实施例1检测结果的说明;附图5是关于实施例2检测结果的说明;附图6是关于实施例3检测结果的说明;
附图7是关于实施例4检测结果的说明;和附图8是关于实施例5检测结果的说明。
有关附图的详细说明参见如下详细描述部分的内容。
发明内容
详述在一项实施方案中,本发明提供利用切口酶扩增靶核酸序列的方法,其包括以下步骤a)使扩增引物与核酸靶分子杂交,其中所述引物的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;
b)用DNA聚合酶合成双链核酸;c)所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;d)DNA聚合酶以切口为起点,以未被切断的另一条核酸链为模板,合成新的双链核酸,并将旧链剥离以作为下一轮核酸合成的模板,同时在新合成的双链核酸上恢复切口酶识别位点;e)重复进行切割、延伸和剥离的步骤,以扩增出靶核酸序列。
关于本发明的切口酶核酸恒温扩增技术(NEMA)的基本原理如附图2中所示。
更具体地,本发明提供利用切口酶恒温扩增靶核酸序列的方法,其包括以下步骤1)使双链核酸靶分子变性,使第一正向引物F1,第二正向引物F2与核酸靶分子负链杂交,其中所述第二正向引物F2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;其中所述第二正向引物F2的浓度应高于第一正向引物F1的浓度;使第一反向引物R1,第一反向引物R2与核酸靶分子正链杂交,其中所述第二反向引物R2的尾部带有一段特异性切口酶的识别序列;其中所述第二反向引物R2的浓度应高于第一反向引物R1的浓度;此后负链和正链进行相同的扩增步骤;以下仅以负链为例说明扩增过程;2)DNA聚合酶延长第二正向引物F2;3)DNA聚合酶延长第一正向引物F1,同时剥离第二正向引物F2的延长链(正链);4)第一反向引物
R1,第二反向引物R2与步骤3)的正链产物4杂交,DNA聚合酶延长第二反向引物R2;
5)DNA聚合酶延长第一反向引物R1,同时剥离第二反向引物R2的延长链(负链),本步骤的产物6为两端固定的负链;本步骤的第一反向引物R1的延长产物12为双链DNA;6)第二正向引物F2与产物6负链杂交,DNA聚合酶延长第二正向引物F2;7)恢复DNA双链结构;在5’末端和3’末端重建内切酶辩认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成DNA新链,同时剥离旧链,此步骤产生的产物9为正链和负链DNA的混合物;步骤5)的延长产物12经步骤12)-14)产生产物8,重回步骤8)以后的扩增过程;8)引物杂交,DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2;9)恢复DNA双链结构;重建内切酶辨认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成DNA新链,同时剥离旧链;10)引物杂交,DNA聚合酶分别延长第二正向引物F2和第二反向引物R2;和11)恢复DNA双链结构;重建内切酶辨认位点;所述切口酶识别特异性核酸序列,在其中一条核酸链上切割形成一个切口,暴露其3’末端;DNA聚合酶从切口处合成DNA新链,同时剥离旧链;此步骤产生的两种扩增物与步骤9)产生的产物10相同,因此可重新进入步