分离hiv-1蛋白酶抑制剂的体系和药物组合物的制作方法.docx

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专利名称::分离hiv-1蛋白酶抑制剂的体系和药物组合物的制作方法
技术领域:
:本发明至少涉及细胞生物学、分子生物学和医学领域,特别涉及治疗HIV/AIDS的药物组合物。
背景技术:
:HIV/AIDS依然是不可治愈的疾病,威胁全球数百万人的生命。鸡尾酒疗法,一般也称HAART或ART,是目前可以使患者的HIV-1降低到能够检测出的水平之下的最为成功的抗逆转录病毒疗法。典型的ART疗法需要联合使用一个HIV-1蛋白酶抑制剂(HIV-1PI)和两个HIV-1逆转录酶抑制剂。在两类抗-HIV治疗药物中,HIV-1PI是最有效的病毒抑制剂,其单独使用也能使病毒减少2-3个数量级。HIV蛋白酶是产生病毒感染力的根本,它能将病毒多聚前体蛋白切割成活性病毒酶(逆转录酶、蛋白酶和整合酶)和结构蛋白。因此,HIV-1蛋白酶被用来生产病毒的结构蛋白和酶,并且对于感染性病毒粒子的成熟也是必须的。目前,获得美国FDA批准的PI—共有8个,所有的这些PI都属于与蛋白酶的活性位点结合的竞争性抑制剂,事实上,这其中的许多PI都是设计成能够与蛋白酶的活性位点结构的匹配。PI与蛋白酶的活性位点的结合阻止蛋白酶切割病毒前体聚合多肽,因而阻断了随后的病毒成熟。
ART疗法面临的主要问题之一是病毒会快速对药物产生抗性,病毒的PI抗性一般是由于蛋白酶基因内逐步累积的突变而出现,并且这种抗性增长迅速。ART治疗失败经常是多抗药性导致,即蛋白酶变得对使用的多数或全部PI有抗性,这瞀示我们HIV多抗药性最终有可能超过目前我们所能获得的PI数量。因而,目前急切需要开发其他能够对有抗药性的蛋白酶具有药效的PI。
发明内容本发明主要涉及一种与HIV治疗药物的筛选和使用有关的体系、方法和药物组合物。特别是,发明人在本领域取得了一定的进步,使得筛选HIV-1蛋白酶抑制剂的标准方法得以发展和利用,当然这个方法也可以替换成HIV-2蛋白酶抑制剂的筛选方法。在本申请文件给出的第一个实施方案中,裂殖酵母因其内的蛋白酶基因高水平表达而致死,这一发现为鉴别蛋白酶抑制剂提供了基础,当蛋白酶基因表达时,可以通过蛋白酶抑制剂具有的使细胞存活生长的能力而将其分离出来。在本发明的一些具体的实施方案中,提供了基于细胞的标准筛选方法,该方法可以鉴别出能同时抑制野生型和具有抗性的蛋白酶的化合物。这些新的抑制剂在某些情况下可能不会与活性位点结合,因此为我们揭示了抑制蛋白酶活性的新途径,即通过耙向蛋白酶的其他区域和功能区。具体地,本发明可以在用于筛选HIV-1蛋白酶的广谱抑制剂的全自动髙通量分子筛选(HTS)方法中采用一些基于裂殖酵母细胞的测试。更具体地,这些测试可以使用
96孔板模式和比较小型化的模式。更具体地,蛋白酶活性的检测可以采用吸光率检测细胞密度,或者也可以采用荧光检测细胞活性,如可以将荧光检测作为进一步的确证实验。在其他的或替代的实施方案中,采用对GFP-底物-Vpr融合蛋白进行绿色荧光重定位来作为检测蛋白酶活性的反向筛选试验。更具体地,这三种检测方法可以被应用到HTS模式中和/或利用一些潜在的抑制剂文库,例如Sigma的LOPAC1280化合物文库。本发明的某些内容中,还提供了在几个水平上来筛选鉴定蛋白酶抑制剂的方法。例如,当蛋白酶基因表达时,将细胞活性作为筛选指标来筛选鉴别一些能够使细胞继续存活生长的蛋白酶抑制剂。基于另一水平的筛选方法,使用体外酶法测定蛋白酶活性的方法来筛选蛋白酶抑制剂,这一方法可以与细胞活性测定方法联合使用,也可以替代细胞活性测定方法,例如酶解蛋白酶底物。虽然在一般的实施方案中酶切位点可以是任何HIV-1能够酶切的合适位点,但在特定的实施方案中,酶切位点序列可以优选SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列。7在另一个实施方案中,采用体外测定蛋白酶活性的方法,蛋白酶活性通过绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中定位来测定。这测定方法提供了一个半定量测定细胞内蛋白酶总活性的方法,能够用于对蛋白酶的底物特异性进行定性。就本发明的不少实施方案来说,例如,分离抑制剂一方面可以去掉因同源重组而缺失表达基因的细胞的背景。例如,将对抗生素
(如G418)具有抗性的多聚核苷酸与蛋白酶多聚核苷酸连接,这些失去蛋白酶基因的细胞能很容易地被鉴别出来且在蛋白酶抑制剂筛选中被去除。这一手段将基因缺失导致的背景降到非常低的水平,以至于它不再能明显干扰蛋白酶抑制剂的筛选。发明人将本发明的一个标准筛选方法,即将具有低背景和成功应用过的程序,应用到筛选裂殖酵母基因组文库的方法中,鉴别出了hhp2基因为裂殖酵母的一个蛋白酶抑制剂。现有技术中,没有任何关于hhp2和HIV-l蛋白酶基因之间关系或者抑制机制可以被定性的报道。因此,hhp2多聚核苷酸是一个新的标准抑制机制,这个发现也为研究抑制HIV-1蛋白酶提供了新的策略。在本发明的一个实施方案中,提供了一种鉴别HIV蛋白酶抑制剂的方法,该方法包括以下步骤首先提供一种酵母细胞,所述的酵母细胞内包含有由编码HIV蛋白酶的基因序列组成的多聚核苷酸;然后将所述的多聚核苷酸置入候选试剂中;再评估以下的其中一项或两项指标1)所述的酵母细胞的细胞活性和/或生长情况;其中,与缺少候选试剂的情况下的细胞进行对比,在所述的候选试剂存在的情况下细胞能够存活的,所述的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂;2)HIV蛋白酶底物的酶切效果,其中能够阻止底物被酶切的候选试剂为HIV蛋白酶抑制剂。更具体地,HIV蛋白酶为HIV-1蛋白酶或HIV-2蛋白酶。在本发明的另一个特定实施方案中,
HIV蛋白酶的表达受到过表达调控序列的调节。更进一步地,这些抑制剂可以是多肽、多聚核苷酸、小分子、抗体,或者以上多种物质的混合物或组合物。酵母细胞优选裂殖酵母,例如粟酒裂殖酵母。在本发明的特定实施方案中,多聚核苷酸被整合到酵母基因组中。过表达调控序列可以选择nmll过表达调控序列、adhl调控序列、fbpl调控序列、invl调控序列,或者在某些情形下也可以是ctr4调控序列。多聚核苷酸可以进一步优选包含至少一个能够在细胞活性测试中减少背景生长信号的片段。在特定的实施方式中,减少背景的组分可以为标记物,例如可以为对抗生素具有抗性的标记物、对G418或潮霉素具有抗性的标记物、营养标记物、也可以选自adel、ade6、arg3、CAN1、his3、his7、leul、leu2、sup3-5、ura3和ura3。在某些具体实施方式中,HIV蛋白酶为人HIV蛋白酶,HIV蛋白酶底物为人HIV蛋白酶底物。更具体地,评估HIV蛋白酶底物的酶切效果可以为评估由第一多肽片段和第二多肽片段组成多肽的酶切效果,其中HIV蛋白酶的酶切位点位于所述的第一多肽片段和第二多肽片段之间。一方面,第一多肽片段中可以为可探测的标记,另一方面,第二多肽片段可以为HIV蛋白酶的底物,例如HIV-1Vpr多肽。具体地,酶切位点为DSQNYPIVQ(参见SEQIDNO:3)、DSFNSTQIT(参见SEQIDNO:4)、VSQNYPIVQN(参见SEQIDNO:8)、KARVLAEAMS(参见
SEQIDNO:9)、SATIMMQRGN(参见SEQIDNO:10)、RPGNFLQSRP(参见SEQIDNO:ll)、VSPNFPQITL(参见SEQIDNO:12)、CTLNFPISPI(参见SEQIDNO:13)、GAETFYVDG(参见SEQIDNO:14)或者IRKVLFLDGI(参见SEQIDNO:15)。优选地,可探测的标记可以是绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白。优选地,该方法还可以进一步包括将治疗有效剂量的所述抑制剂输送到感染HIV病毒或者患有AIDS的个体的步骤。另外优选地,该方法也还进一步包括将有效剂量的所述抑制剂输送到可能感染HIV病毒或可能患上AIDS的个体来作为预防的步骤。在本发明的一个实施方案中,提供了一种治疗感染HIV病毒或患AIDS的个体,该方法包括将治疗有效剂量的包含有hhp2的药物组合物输送到患者体内的步骤。具体地,hhp2是一种多聚核苷酸,优选编码hhp2多肽的多聚核苷酸。序列表中如SEQIDNO:16所示()提供了粟酒裂殖酵母的hhp2多聚核苷酸的标准序列。粟酒裂殖酵母hhp2多肽的标准序列参见序列表中SEQIDNO:17()所示。从蛋白序列和结构来看,裂殖酵母hhp2与人类酪蛋白激酶1(CKl)同源;CKl多聚核苷酸的标准序列参见序列表SEQIDNO:18(),CKl多肽的标准序列参见序列
表SEQIDNO:19()。本发明的药物组合物,如用于治疗HIV或AIDS的药剂具有HIV-1和/或HIV-2蛋白酶抑制剂功能,例如其序列可能为序列表SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或者SEQIDNO:19所示,或者这些药物组合物中包含有与序列表SEQIDNO:169或SEQIDNO:17所示序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的相似性的分子。在本发明的一个特定实施方式中,提供了一种包含有编码HIV蛋白酶的多聚核苷酸的酵母细胞。具体地,HIV蛋白酶可以优选HIV-1蛋白酶或者HIV-2蛋白酶。具体地,可以优选其表达受到过表达调控序列的控制的多聚核苷酸。再进一步地,多聚核苷酸可以为标记物,例如对抗生素具有抗性的标记物,进一步优选营养标记物。另一方面,酵母细胞内也可以进一步包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸,其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。更进一步地,第一多肽片段中包含有可检测的标记,例如绿色荧光蛋白、翠绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或者青色荧光蛋白;第二多肽片段也可以优选HIV-1的Vpr多肽。另外,酵母细胞可以是酵母细胞培养物或者酵母细胞克隆。在本发明的一个补充实施方案中,提供了治疗和/或预防感染HIV和/或患上AIDS的药物组合物试剂盒,该试剂盒中包含有装在合适的容器中的编码
hhp2的多聚核苷酸或hhp2多肽。具体地,该试剂盒还可以进一步包含药学上可以接受的赋型剂。本发明的另一个具体的补充实施方案中,提供了用于筛选一个或多个HIV蛋白酶抑制剂的试剂盒,该试剂盒中包含有本发明的酵母细胞。更具体地,本发明的酵母细胞还可以进一步包含有由编码第一多肽片段的第一序列和编码第二多肽片段的第二序列组成的多聚核苷酸,其中HIV蛋白酶的酶切位点位于第一多肽片段和第二多肽片段之间。上述内容已经列出了本发明的足够多的技术特征以及技术进步,能够帮助理解下面的本发明详细说明。本发明的其他的技术特征以及技术进步将会在下文中介绍,这些也成为本发明权利要求书中的要求保护的主题。凡根据本发明申请文件中提供的发明构思和具体实施方式所作的等效变化或修饰,都是本领域技术人员能够想到的;同样的,凡是属于本发明的精神实质和权利要求书所确定的范围的等同发明也是本领域技术人员能够想到的,都应涵盖在本发明的保护范围内。为了让本领域技术人员能够更好地理解本发明的发明点、本发明的组成和实施方法、以及进一步改进的技术方案和技术进步,下面将结合具体实施方式和附图对本发明进行详细的说明。然而,提供的具体实施方式和附图内容只为解释和说明本发明,并不能视为对本发明保护范围的限制。为了更好的理解本发明,下面列出作为参考。图
1示出了在髙背景下筛选抑制剂时,通过同源重组去除整合酶基因;图2表明蛋白酶附近的卡那霉素抗性基因,用于鉴别同源重组导致的缺失。图3示出了通过同源重组整合进入iimtl位置的质粒;图4示出了分离的两株G418抗性菌株,当蛋白酶表达时它们的生长被强烈抑制;图5阐明诱导平板上未形成克隆的细胞;图6,蛋白酶表达被抑制后失去活性;图7,使用GFP-Vpr融合蛋白重定位监测蛋白酶活性;图8,HIV-1蛋白酶不影响GFP的定位;图9,蛋白酶没有使GFP-Vpr重新定位到细胞质;图10,蛋白酶使GFP-SLMa-Vpr中的GFP再次定位到细胞质;图11,蛋白酶使GFP-SLp6-Vpr中的GFP再次定位到细胞质;图12,蛋白酶没有使GFP-SLA-Vpr中的GFP再次定位到细胞质;图13,与PrliitB菌株相比,PrliitBG418抗性菌株生长受到抑制;图14,尽管nmtl启动子不同,两典型菌株都有单个质粒整合进入iimtl位点;图15,以GFP百分比(GFP%)的方式反映蛋白酶活性;图16,印地那韦(indinavir)蛋白酶对生长的作用;图17,印地那韦(indinavir)阻止GFP-SLp6-Vpr中的GFP重新定位于细胞质图18,随着印地那韦(indinavir)浓度的增加,GFP减少;图19,印地那韦(indinavir)促进克隆斑形成;图20,1000个细胞中只有1个可以在诱导平板上形成克隆;图21,诱导平板上的大多数克隆缺少卡那霉素抗性;图22,对G418复制子来源的克隆重新测试,表明大多数有蛋白酶基因;图23,使用
PrIndA菌株进行蛋白酶抑制剂的低背景筛选;图24,背景举例,包括G418抗性和在T平板上的猛烈生长;图25,T培养基上的快速生长与质粒无关;图26,诱导平板上生长的背景菌株和正常菌株均的蛋白酶基因均有移码突变;图27,弱抑制剂质粒的分离;图28,依赖于质粒的弱抑制;图29,在大肠杆菌复活后,一个典型质粒(pPS3-3)并没有像其他的一样进行重测;图30,ll个复活质粒中的IO个重新检测,为生长的弱抑制剂;图31,ll个复活质粒中的IO个重新检测为增加细胞活性的弱抑制剂;图32,10个典型的抑制剂质粒都含有hhp2基因。,本发明说明书和权利要求书中使用的英文词汇"a"和"an"表示"一个或多个"。本发明的一些实施方式中可能包含或本来就包含了一个或多个组分、步骤和/或方法。本申请文件中所提供的任何方法或组合物也可以替换成本领域技术人员所能够想到的其他方法或组合物。,2005年大约有4000万人感染或携带HIV,每年约有400万新感染者。在美国,HIV是25到44岁成年人的第二大杀手。HIV-1蛋白酶是最清楚的最成功的治疗HIV感染的药物靶标。蛋白酶产生于一个非活性的Gag-Pol前体聚合蛋白,在翻译过程中移码阅读产生。蛋白酶在聚合蛋白的9处切割蛋白,释放出感染性病毒组装所必需的包括完全活性蛋白酶在内的各种蛋白。既然蛋白酶作用过程是产生病毒粒子的重要步骤,蛋白酶成了抗