文档介绍：基因多态性分析
人
一、实验目的
1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。
2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。
二、实验原理
基因多态性(gene polymorphism)是指在一个生物群体中,同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因,也称为遗传多态性(ic polymorphism)。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义;与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记,并为分离克隆致病基因提供依据;病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析,可用于辅助筛选致病易感基因。
聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异(多态性),且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上,使酶切位点增加或者消失,则酶切结果就会产生大小不同的片段,即片段长度多态性,再利用琼脂糖凝胶电泳分离,可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较,可确定是否变异。应用PCR-RFLP,可检测某
一致病基因已知的点突变,进行直接基因诊断,也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。
三、器材与试剂
1. 器材
⑴离心机。
⑵DNA扩增仪。
⑶电泳仪。
⑷水平电泳槽。
⑸紫外检测仪。
⑹移液器。
2. 试剂
⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。
⑵琼脂糖。
⑶1×TAE电泳缓冲液:980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。
⑷50×TAE母液:Tris 121g, EDTA()50ml,冰醋酸 ,定容至500ml。
⑸上样缓冲液(6×):30mM EDTA,40%(V/V)甘油,%(W/V)二甲苯青FF,%(W/V)溴酚蓝。
⑹10 mg/ml溴化乙锭(EB)。
⑺DNA Marker。
四、实验方法
⑴细胞采集:
口腔拭子(消毒后的棉签)擦拭两侧脸颊各10次,采集口腔粘膜脱落细胞,将拭子转置于2mL离心管中,用剪刀将棉签部分剪下,加入DNA抽提试剂盒中的400μL缓冲液GA。
注意:为了保证样本不被食物或者饮料污染,取样前30分钟内请勿进食和饮水。
⑵DNA提取:
参照试剂盒说明书操作。
⑶样品保存:
DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。下次实验再用。
2. DNA浓度及纯度检测
可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA样品的浓度与纯度。⑴琼脂糖凝胶电泳法定性检测DNA
参照《实验16 DNA琼脂糖电泳》。
⑵紫外分光光度法定量检测DNA浓度及纯度
参照《实验20 动物肝脏DNA的提取和检测》。测定浓度后,。
3. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析
⑴查找基因序列
选择你感兴趣的目的基因,首先查