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专利名称:使用葡萄糖脱氢酶的葡萄糖浓度测定方法及葡萄糖传感器的制作方法
技术领域:
本发明涉及用于测定试料液(例如血液等的生化试料或其调整液)的葡萄糖浓度的技术。
背景技术:
对于糖尿病患者,为了管理血糖值而在平日掌握自己的血糖值是很重要的。而由于频繁地到医院去是非常麻烦的,所以那种患者自己可以进行简单的血糖值测定,而且在外出时也可以轻松地进行血糖值测定的可以放在手掌里那样大小的便携式的简易血糖值测定装置就得到了应用。
在使用便携式的简易血糖值测定装置时,将提供有酶反应场的葡萄糖传感器装在血糖测定装置上,通过向葡萄糖传感器供给血液(试样)而进行血糖值的测定。在这种情况下,一般使用切开测定者的皮肤后采血、而将该血液作为试料液供给至葡萄糖传感器的方法。在这种方法中,从减小采血对于测定者的负担的角度看,由于要采取的血液量最好较少,所以为了能用少量的血液(试样)而能够进行血糖值测定,进行了各种各样的研究改进。
葡萄糖传感器被作成例如在基板上形成电极及试药层的同时,以将该试药层收容到内部的形态设置毛细管的结构
(参照图2及图3)。虽然试药层是作为包含氧化还原酶和电子传递物质而构成的,但是普遍使用GOD或PQQGDH作为氧化还原酶,使用铁***化钾作为电子传递物质(例如日本国特开2000-65778号公报)。在这种葡萄糖传感器中,利用毛细管向试药层供给试样时,在毛细管的内部构筑液相的反应体系。这时,由氧化还原酶催化例如葡萄糖的氧化反应,而又催化电子传递物质的还原反应。
与此相对,在简易血糖值测定装置中,利用葡萄糖传感器的电极,通过对反应体系施加电压从而测定响应电流值。该响应电流值,起因于还原型的电子传递物质的量(与葡萄糖的浓度相关的量),被作为计算葡萄糖浓度时的基础。在计算葡萄糖浓度时,采用电量检测法或电流检测法。电量检测法是试样中的几乎全部的葡萄糖反应后、取得计算用的响应电流值的累积值、根据累积值(电量)计算葡萄糖浓度的方法。而电流检测法则是在反应开始经过一段时间后取得响应电流值、根据该响应电流值计算葡萄糖浓度的方法。
由于GOD与葡萄糖的反应速度较小(Km(米氏常数)较大),所以在使试样中的大部分葡萄糖反应而取得运算用的电量的电量检测法中,测定时间显著地增长。因此,在使用GOD作为氧化还原酶以短时间测定葡萄糖浓度的情况下,要利用电流检测法。
但是,在电流检测法中,在葡萄糖浓度较小的情况下,在取得响应电流值的阶段,也许酶反应几乎结束了,所得到的响应电流值要小,低浓度区域的测定精度变差。在微量试样时,由于葡萄糖的绝对量小,所以会产生同样的问题。为了消除这种缺陷,使所使用的酶量变少即可。但是,在酶量较少的情况下,由于葡萄糖的反应速度较小,所以在一定以上的葡萄糖浓度的试样中,葡萄糖反应量之差不能反映出葡萄糖浓度之差。其结果是,若酶量较少,则在高浓度区域不能以响应电流值之差得到葡萄糖浓度之差,分解能恶化。因此,可以说电流检测法是测定范围小、不适于微量试样的测定的方法。
而且,GOD与电子传递物质的反应性也不那么大。因此,为了缩短测定时间,需要多量地使用电子传递物质。其结果是,难以使葡萄糖传感器(正确地说是试药层和毛细管)小型化,随之也要使必要的试样量增多。从这点上来看,可以说使用GOD的方法也不适于测定微量试样的情形。
根据这些情况,在使用GOD的电流检测法中,可以精度良好地测定葡萄糖的试样量,,测定时间最小为15秒,测定范围限于葡萄糖浓度为10~600mg/dL。
另一方面,在采用PQQGDH作为氧化还原酶的情况下,若采用电量检测法,,也可以测定血糖值,这是已知的。可是,如上所述,由于电量检测法是利用试
样中的几乎全部的葡萄糖来计算葡萄糖浓度的方法,所以与电流检测法相比,在葡萄糖高浓度区域存在着测定时间相对地变长的倾向。例如,为了确保实用上所需要的最低限的测定范围(10~600mg/dL),需要确保15~30秒的测定时间。
为了缩短测定时间,也可以考虑增加试药层中的酶和电子传递物质的含量,在这样情况下试药层的溶解性恶化。所以,在向毛细管供给试样时,在毛细管中构筑均匀液相的反应体系变得困难。其结果是,由于每个葡萄糖传感器(每次测定)的溶解程度之差而使再现性恶化,或变得容易受到血液中的血球成分的影响等,而产生测定精度恶化的问题。特别是,由于铁***化钾对血液的溶解性小,所以在使用铁***化钾作为电子传递物质的情况下,测定精度的恶化显著。另外,铁***化钾保存稳定性差,容易向还原体转化,所以如果含量增多的话,与背景的增大相关联,这次是葡萄糖低浓度领域的测定精度降低。
发明内容
本发明的目的在于确保测定范围大、并且可以短时间且高精度地测定微量试样。
在本发明的第1方面中,提供一种利用包含酶及电子传递物质的反应体系而测定葡萄糖浓度的方法,其中,使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶作为上述酶,使用Ru化合物作为上述电子传递物质。
作为细胞色素C来说,优选使用由属于伯克霍尔德氏属的微生物所产生的细胞色素C。作为细胞色素C来说,可以使用在还原条件化的SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳中分子量约为43kDa的细胞色素C。
在本发明的第2方面中,提供一种利用包含酶及电子传递物质的反应体系而测定葡萄糖浓度的使用了葡萄糖脱氢酶的葡萄糖浓度测定方法,其中,使用源自伯克霍尔德氏属的葡萄糖脱氢酶作为上述酶,使用Ru化合物作为上述电子传递物质。
在本发明的葡萄糖浓度测定方法中,例如一方面对反应体系给予刺激,另一方面检测针对该刺激的响应,根据该响应的检测量计算葡萄糖浓度。在这种情况下,例如以电压的方式给予刺激,以电流或光学特性得到响应。
在本发明的第3方面中,提供一种葡萄糖传感器,其具有第1及第2电极、包含酶及电子传递物质的试药层,在向上述试药层供给葡萄糖溶液而构筑反应体系的同时,利用上述第1及第2电极给予该反应体系以刺激,其特征在于使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶作为上述酶,使用Ru化合物作为上述电子传递物质。
作为细胞色素C来说,优选使用由属于伯克霍尔德氏属的微生物所产生的细胞色素C。作为细胞色素C来说,可以使用在还原条件化的
SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳中分子量约为43kDa的细胞色素C。
在本发明的第4方面中,提供一种葡萄糖传感器,其具有第1及第2电极、包含酶及电子传递物质的试药层,在向上述试药层供给葡萄糖溶液而构筑反应体系的同时,利用上述第1及第2电极给予该反应体系以刺激,其特征在于使用源自伯克霍尔德氏属的葡萄糖脱氢酶作为上述酶,使用Ru化合物作为上述电子传递物质。
在本发明中,可以使用具有葡萄糖脱氢酶活性并且在还原条件化的SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳中分子量约为60kDa的具有α亚单位的酶作为葡萄糖脱氢酶。葡萄糖脱氢酶也可以是在还原条件化的SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳中分子量约为14kDa的γ亚单位的酶。
在本发明中,例如可以使用下述化学式所示的配位化合物作为Ru化合物。
n+作为上述化学式中的X来说,可以举出NH3、卤素离子、CN、吡啶、烟酰***、或H2O。在例示的物质之中,优选使用X是NH3或卤素离子的Ru配位化合物。另一方面,在化学式中的n+表示由X的种类所决定的Ru配位化合物的价数。
由于还原型(II)不稳定,所以Ru配位化合物通常作为氧化型(III)而存在。所以,即使在葡萄糖传感器的试药层中混入了氧化型Ru配位化合物的状态下并且曝露在光或水中,也不容易被
还原。另外,Ru配位化合物具有难以结晶化、可以适当地维持微粉末状态的特性。从这点来看,可以说Ru配位化合物的溶解性高。因此,在考虑耐曝露性或保存稳定性等的情况下,对于试药层而言,优选以氧化型含有Ru配位化合物。
本发明的葡萄糖传感器的结构是,例如设置有试药层,而且还具备用于保持试料液的液保持空间。在这种情况下,就试药层来说,以固体层的方式构成的同时,在液保持空间保持试料液的状态下,氧化还原酶及电子传递物质的至少一部分溶解于试料液中。即,葡萄糖传感器的结构优选是,在试料供给后,在液保持空间内,由葡萄糖、氧化还原酶及电子传递物质以液相构筑反应体系。
就液保持空间的容量来说,为了可以测定微量试料液,~。在这种情况下,试药层中的氧化还原酶的含量,~。将一个酶单位(U)定义为,在标准检定条件(、37℃)下,在作为DCIP的吸收波长的600nm处,随着时间变化测量基于DCIP(2,6-二***酚靛酚)还原的退色时,每分钟氧化1μM葡萄糖的量(×1000μM/cm)。另一方面,试药层中的电子传递物质的含量是换算为例如液保持空间被试料液充满时的电子传递物质的浓度后、~%的量。
液保持空间的结构是由毛细管力而使试料液移动的结构。
在本发明中所说的属于伯克霍尔德氏属的微生物,只要是可以产生具有葡萄糖脱氢酶活性的α亚单位、或包含细胞色素C(β亚单位)的酶(以下,有时简称为“GDH”)的微生物,则不作特别限定,但是,在其中,优选为洋葱伯克霍尔德氏菌,特别优选是洋葱伯克霍尔德氏菌KS1(以下,有时简称为“KS1株”)。KS1株是从温泉附近的土壤中分离的新菌株,但从其菌学的性质来看,确定为洋葱伯克霍尔德氏菌,于平成12年9月25日以微生物委托号第FERMBP-7306号寄存于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄托中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。KS1株可以产出包含α亚单位(分子量约为60kDa)、β亚单位(相当于细胞色素C)(分子量约为43kDa)、γ亚单位(分子量约为14kDa)的GDH。但是,分子量是在还原条件下的SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳中测定的。
细胞色素C(包含β亚单位)是电子传递蛋白质,从提高电子传递速度的观点来看,对于具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位(包含α亚单位),以结合细胞色素C的形态,作为GDH(以下,有时简称为“CyGDH”)使用是优选的。就细胞色素C来说,不限于源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的细胞色素C(β亚单位),只要是与具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位结合可以发挥电子传递功能,也可以是源自其它的微生物或活体细胞的细胞色素
C。
α亚单位是如已经叙述那样具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位。由α亚单位和γ亚单位构成的GDH(以下有时简称为“αGDH”),与没有γ亚单位的GDH相比,与葡萄糖的反应速度大(Vmax/Km值大)。对于这一点,由本发明者们确认了。因此,从提高与葡萄糖的反应速度的观点来看,在使用α亚单位的情况下,以使γ亚单位与α亚单位结合的形态,作为GDH使用是优选的。
另外,在本专利申请的范围,有时根据来源菌种限定α亚单位、细胞色素C(包含β亚单位)或γ亚单位,但这只不过是用于限定各亚单位的简便方法而已。即,即使在将包含作为目的的亚单位的表达编码的载体转入宿主,将从该宿主产出的GDH作为葡萄糖脱氢酶使用的情况下,在不同点仅仅是GDH(亚单位)的起源时,为了慎重起见,在此再确认一下,这种情况属于本发明的技术范围。
图1是表示在浓度测定装置上安装了本发明的葡萄糖传感器的状态的图,对于浓度测定装置来说,用框图来表示,而对于葡萄糖传感器来说,用平面图来表示。
图2是表示葡萄糖传感器的一个例子的全体立体图。
图3是图2的葡萄糖传感器的分解立体图。
图4是表示在葡萄糖浓度的测定中、施加于第1及第2电极之间的电压值及响应电流值的随时间变化的一个例子的图。
图5是表示在葡萄糖浓度的测定中、施加于第1及第2电极之间的电压值及响应电流值的随时间变化的其它例子的图。
图6A~图6D是表示在使用Ru配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度与反应开始5秒钟后的响应电流值之间关系的图。
图7A~图7D是表示在使用铁配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度与反应开始5秒钟后的响应电流值之间关系的图。
图8A~图8D是表示在使用Ru配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度与反应开始10秒钟后的响应电流值之间关系的图。
图9A~图9D是表示在使用铁配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度与反应开始10秒钟后的响应电流值之间关系的图。
图10A~图10D是将血细胞比容(Hct)的影响作为从反应开始经过特定时间后的Bias(Hct42%基准)而进行了评价的图。
具体实施例方式
以下,参照附图对用于实施本发明的优选方式进行说明。
图1所示的浓度测定装置1是使用本发明的葡萄糖传感器2来测定血液等包含葡萄糖的试料液中的葡萄糖浓度的装置。这种浓度测定装置1是大致具有电压施加部3、电流值测定部