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专利名称:使用编码的微载体进行的基因组选择和测序的制作方法
技术领域:
本发明涉及核酸杂交和测序方法。本发明进一步涉及使用编码的微载体进行的核酸片段的选择、测序和鉴定。
背景技术:
最近的测序技术使得同时测定大量核苷酸序列。这取消了对在不同的毛细管或分离的反应孔中进行分离的测序反应的需要。通常地,DNA样品通过机械或酶促技术被片段化,其后单个的DN***段经由连接到片段的一种类型的核苷酸接头分子被结合到基质、例貪反应室的壁或微载体/珠),所述核苷酸接头分子也发挥通用引物的功能。对于多于单个分子测序的技术,基于PCR的扩增步骤如下。例如,测序技术例如“4M”焦磷酸测序(Roche)利用单个的微珠作为基质,其在反应室微孔中设置。随后,在所有技术中,核苷酸逐步参入并对于结合基质的各个DNA分子进行鉴定。该过程重复多次并将所有单个的片段的测序读码进行比对以得到所研究的靶DNA样品的完整序列。这些技术在本领域已知为“下一代测序”并被例如Helicos,Illumina和AppliedBio系统和Roche等公司商业化。下一代测序方法要求同时进行的不同反应可在物理上各自分离。DNA样品的富集可以在测序前进行以降低样品的复杂性和选择基因组的特定区域用于测序。方法描述在
Hodges等人Q007)NatureGenetics39,1522-1527中以选择或富集基因组DN***段用于随后测序,其通过选择杂交探针来进行。已发展了更多种多样的方法用于DNA杂交,其中多路方法部分或完全在溶液中进行和其中使用具有不同颜色的微载体或使用编码的标志物索引单个反应(所综述的Braeckmans等人Q002),447-448)。在该内容中,Braeckmans等人(2003),169-173表明光漂白的编码的颗粒用于DNA杂交测定的用途。目前测序方法的缺点是可被测序的DNA的相对短的单个阅读长度,导致具有有限信息含量的序列。这使得在参考基因组序列中定位测定的序列通常困难(序列注解)。特别困难的是硫酸氢盐测序的情况下,其中在测序反应之前,在片段的CpG序列中的未***化的C核苷酸转换成T核苷酸,导致用于与参考基因组进行测序读码比对的减少的信息和因此在最终核酸序列的正确组装中增加的难度。特别对于未来临床诊断应用,例如癌症测序,微生物学和临床遗传学,加快测定患者基因组样品的序列的时间和获得最高的可能准确度应是有利的。发明概述
本发明的具体和优选方面在所附独立和从属权利要求中阐述。从属权利要求的特征可与合适的且不只是权利要求中明确阐述的独立权利要求的特征和其他从属权利要求的特征组合。本发明涉及用于测定靶核酸分子的序列的方法,所述方法包括以下步骤
a)提供与编码的微载体连接的俘获寡核苷酸探针,其中所述微载体的代码(代码)鉴定所述寡核苷酸探针的序列和/或其在参考基因组上的位置,
b)将所述俘获寡核苷酸探针与包含核酸分子的样品杂交,其中所述核酸分子包含至少部分与俘获寡核苷酸探针的序列互补的序列,
c)通过产生至少2个核苷酸的序列阅读,测定步骤b)的杂交的核酸分子的序列,
d)测定微载体上的代码,
e)如步骤d)中所测定的,鉴定与微载体上的代码相对应的俘获寡核苷酸探针的核苷酸序列以及其在参考基因组上的位置,
f)将步骤c)中测定的序列信息与步骤e)中鉴定的信息组合以测定靶核酸分子的序列。步骤c和d可以任何顺序进行。目前本领域已知的方法包括将DNA样品的选择的部分与一组探针结合的步骤。单个的DN***段与在阵列上的各个探针杂交的信息有丢失,因为所有杂交的DN***段从阵列中释放并在进一步测序步骤中批量处理。以上确定的问题通过根据本发明的方法解决。本发明引起测定的序列的信息量增加,而同时利用了最近开发的DNA测序技术的优势,例如大通量和速度和灵
敏度。本发明精良地显示基因组富集/选择和测序步骤的整合,提供了最小化的测定时间和样品损失以及因而诊断测序测试的改进的特异性。方法促进了测定与参考序列比较的靶核酸分子的序列改变。在优选实施方案中,靶核酸分子包含至少2个核苷酸探针序列。本发明另一个实施方案是用于测定核酸样品的序列的设备,所述设备包含用于将俘获探针与核酸退火的部件,用于测定DNA分子的序列的部件,用于操作微载体的部件和用于测定微载体的代码的部件。在本发明的方法的具体实施方案中,使用多个不同编码的微载体,其中每个代码对应于俘获寡核苷酸探针的唯一序列。优选地,编码的微载体在所述方法的一个或多个步骤中处于悬浮液中。在本发明的方法的其他具体实施方案中,微载体是磁性颗粒或带电颗粒。任选地,在步骤d)中,载体位于磁场中。
在本发明的方法的具体实施方案中,在步骤d)中,编码的载体的代码用光学方法测定。微载体可以是荧光颗粒,其中通过光漂白应用代码。序列测定可以例如通过测定参入的荧光核苷酸的荧光共振能量转移(FRET)进行,但是多种其他已知的测序化学方法是可用的。在本发明的方法的具体实施方案中,步骤c)中测定的序列的长度可具有20-40个核苷酸的长度。如本发明所用的DNA样品可以通过片段化基因组DNA(例如用限制酶)产生。使用这类片段化方法,通过选择特定的限制酶可以选择足够长度的片段化
DNA。优选长度为200-1000个碱基对。本发明另一方面涉及设备用于测定核酸样品的序列,所述设备包含用于将俘获探针与核酸退火的部件,用于测定DNA分子的序列的部件,用于操作微载体的部件和用于测定微载体的代码的部件。这类设备可以是微流设备。在具体实施方案中,用于操作微载体的部件包含用于施加至少一个磁场的装置。根据本发明的方法和设备显著地增加测序的DN***段的信息含量。在现有技术中,接头DNA序列用于将DN***段随机固定至基质。在本发明中,DN***段经由与互补DNA寡核苷酸探针(俘获探针)杂交被固定至微载体。使用的微载体被编码为识别俘获探针的序列。在本发明的方法中,俘获探针发挥特定地从全基因组DNA中提取DN***段的功能,类似基于微阵列的基因组选择(MGS)技术。俘获探针任选地进一步发挥作为引物的功能用于基于DNA聚合酶的DNA扩增(PCR-克隆步骤)或单个分子测序方法。本文优选地仅一个DN***段结合一个微载体。杂交的(俘获的)DN***段的信息,或在测序步骤后,测序的片段的信息与俘获探针的信息组合(通过测定微载体上相应代码进行)。编码的微载体的使用使得在溶液中进行反应步骤和操作的全部或部分。通过从来自俘获探针的序列和测定的序列获得的序列信息的增加将显著降低序列组装的时间并将需要复杂度较低的软件和硬件。本发明的以上和其他特征、特点和优势将从以下详述结合附图中变得显而易见,
所述附图通过举例说明本发明的原理。给出的该说明仅用于示例目的,而不限制本发明的范围。以下引用的参考图是指附图。附图简述
图1示意性比较现有技术杂交方法(A)与根据本发明的一个实施方案的杂交方法⑶。A:DN***段(实线)与连接到不具有代码的微载体的接头(虚线)连接。B:DN***段(实线)与连接到编码的微载体的俘获探针(点线)杂交。发明详述
本发明应参考具体实施方案和参考特定附图描述,但是本发明不限于此,本发明仅被权利要求限定。权利要求中的任何参考标识不应解释为限制范围。所述附图仅是示意性和非限制性的。在附图中,一些元件的大小可被放大,并且按比例绘制以用于说明性目的。当本说明书和权利要求使用术语“包括”时,其不排除其他要素和步骤。当提及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“一”或“其”(“a”或“an”,“the”)时,这包括该名词的复数,除非另有特别说明。另外,在说明书和权利要求中术语第一、第二、第三和类似术语用于区别相似的要素而对描述连续的或时间顺序是非必要的。应理解的是如此使用的术语在适当的环境中是可互换的,本文中所描述的本发明的实施方案能够以其它而非本文中描述或举例的顺序进行。以下术语或定义单独提供以帮助理解本发明。这些定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。如本发明所用的“(微)载体”涉及颗粒,优选固体颗粒,具有直径
-1000微米。同义词是“(微)珠”、“(微)颗粒”或“(微)球”或“纳米线”。微珠的形状被认为是本发明的限制。如本发明所用的“俘获探针”涉及寡核苷酸分子(或其部分),其特定地结合互补核苷酸序列。如本发明所用的“编码的”涉及微载体的可检测性质、例如跳,图案,字母数字信息),其允许将一种微载体与另一种微载体区别。在其最简单的意思中,其指两种微载体的区别。如本发明所用的“代码”(“代码”)指微载体上的设备可读代码,确保至少100、250、500,1,000,2500,5000或10,000的复杂度。由聚合酶依赖的核苷酸参入或连接酶依赖的寡聚体添加测定的DNA序列还称为“序列阅读”。核酸通常为DNA,但是方法也可应用于RNA(例如信使RNA(mRNA)或微RNA),其也可与寡核苷酸俘获探针杂交并可使用基于逆转录酶的方法被转换成DNA。在这些方法中,俘获寡核苷酸探针可用于步骤c)作为DNA聚合酶的测序引物。本发明涉及杂交和DNA测序方法。根据本发明的方法可应用于任何测序方法,包括基因组的构象测序以测定物种的株(具体)和世系(race)之间的基因多样性,或基因组的肩关测序。具体实施方案指单个的哺乳动物(特别是人)基因组的测序以鉴定个体的SNP。样品和核酸片段化
通过使用本发明的方法可以对全基因组DNA选择的部分进行测序。可选地,碰例如分离个别染色体或经由资/貪脉冲场电泳分离片段来部分纯化样品。在与微载体孵育之前,基因组
DNA被片段化至选择的长度。通常使用标准技术将样品基因组DN***段化,递送在80—1000个核苷酸的选择的范围中的片段,但是优选长度取决于俘获探针的选择的长度,并通常长于俘获探针的长度。片段可以使用物理方法获得(例如超声处理,物理剪切)。DN***段也可使用限制酶(或不同的限制酶的组合)获得,其提供具有确定长度的可预测的和可重复的片段混合物。片段的平均长度可以通过选择短识别位点(导致大量的短片段)或长识别位点(导致少量的短片段)或组合被调整。当使用具有已知的参考基因组序列的全基因组DNA样品时,使用限制酶使得对片段长度和片段末端序列的精确预测。这使得可预测在杂交的探针的3’和5’端未杂交的序列的长度,其在探针3’端的部分可被测序以产生序列阅读。可选地,RNA可用作样品。RNA可以使用基于逆转录酶的方法被转换成DNA。转换后,样品可以如任何其他DNA序列被处理。微载体
本发明所用的微载体由使得寡核苷酸“俘获探针”结合到微载体上的材料制成或用这种材料官能化。寡核苷酸与微载体的偶联是本领域熟知的。该偶联可以是不可逆或可逆的(例如通过硫醇基、酸性基团或不稳定的碱性基团)。在根据本发明的方法中,(并且这与微阵列技术相反),俘获探针不被基质上的它的坐标(co-ordinate)鉴定但是被微载体的代码或性质鉴定。结果,具有俘获探针的编码的微载体可以在所述方法的至少一个步骤或甚至全部步骤中存在。如本发明所用的微载体可在形状、大小、多孔性、材料和其他特征上变化,取决于对在其中进行根据本方法的测序方法的测定或设备的要求。如本发明所述的方法可以在存在不具有或具有改装的测序装置的情况
下进行。因此,直径约1Mm或约40Mm的微载体分别适于ABI固体测序和‘妨4’测序。在某些实施方案中,颗粒具有允许在微流设备中操作颗粒的大小和形状。微载体可具有电荷以允许在电场中操作。
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在其他实施方案中,载体是磁性的或可磁化的颗粒,其允许在磁场中操作、旋转或定位。在其他实施方案中,颗粒使用光钳定位和/或操作。如本发明所用的微载体进一步包括代码,其允许多个载体中鉴定单个的载体。载体的编码在多路方法中是长期已知的,其中载体用具有不同的吸收或发射最大值的发色、例如标记官能化。例如Luminex(Austin,Texas)提供微载体,包含不同浓度的两种染料,导致100种不同的混合。编码的较高复杂度可通过使用资/貪量子点获得,使用10强度水平和6种颜色允许直至一百万的复杂度。在具体实施方案中,高复杂度可通过使用通过使用非发色条码方法获得,允许大于100000,大于一百万或甚至直至一千万或一亿的的复杂度。不同类型的条码是本领域已知的和包括使用无线射频标签的电子条码、激光蚀刻条码、金属纳米棒