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专利名称:作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白的制作方法
背景技术:
保持血管内促凝和抗凝活性之间的适当平衡对于正常止血是必要的(Davie,.(1991)Biochemistry,30(43)10363-10370)。扰乱该平衡使之偏向于凝血将造成血栓形成,这会引起心脏病发作、卒中、肺栓塞和静脉血栓形成。需要更有效和更安全的抗凝剂来治疗特殊的血栓性疾病。
组织因子(“TF”)是一种跨膜糖蛋白,它是凝血级联系统的主要起始物(Nemerson,Y.(1995)(1)180-184)。在正常的生理条件下,活性TF不和血液接触。在血管受损期间,暴露于血液的内皮下TF和胶原导致凝血因子和血小板的活化并随后形成止血栓子。在多种临床情况中,对TF表达的不正确的诱导将造成威胁生命的血栓形成和/或引起病理性并发症。相信斑块(plaque)破裂后的TF暴露是造成引起急性心肌梗死和卒中的血栓性阻塞的原因。在这些情况中,凝血因子所激活的促炎症信号途径也引起水肿形成以及增加梗死面积。与血管成形术相关的血管损伤造成了SMC上TF的上调,相信这诱导了与再狭窄所相关的细胞信号途径。在癌症和革兰氏阴性细菌脓毒症中
TF的过表达造成了威胁生命的血栓形成以及炎症途径的激活。
因子VIIa(“FVIIa”)/TF复合物涉及多种血栓性疾病的发病机制,TF的循环水平是某些患者的危险因素。FVIIa和TF在血管损伤中保持止血以及触发血栓形成上发挥着独特的作用。TF正常地表达于外膜,但在血管疾病中TF于中膜和新生内膜被上调并被不适当地表达。TF在动脉粥样硬化斑块中的表达增加,并且被一薄层纤维帽(fibrouscap)将其与血液分隔,该纤维帽可以破裂并暴露TF。例如球囊血管成形术、支架植入或动脉内膜切除术的外科手术破坏血管壁并暴露出其下的TF。在动脉粥样硬化的、富脂的、薄壁的斑块中,自发性破裂或内皮侵蚀造成TF的暴露和血栓形成,引起不稳定的绞痛和心肌梗死。TF可以在细胞来源的微粒中循环,在不稳定绞痛中循环TF的水平是增高的,说明这种循环TF可以引起血栓形成(Soejima,.(1999)Circulation99(22)2908-2913)。癌症通常与高凝状态相关,这是因为TF在肿瘤细胞上的过表达。这使得患者容易发生深静脉血栓形成,肺栓塞和低度弥漫性血管内凝血(“DIC”)。DIC造成了引起多器官衰竭的微血管内纤维素的沉积。来自血栓形成的急性动脉损伤模型的结果表明基于蛋白质的FVIIa/TF抑制剂,如活性位点抑制因子VIIa(“FVIIai”)以及组织因子途径抑制物
(“TFPI”)是有效的抗凝剂,而且与凝血酶和因子Xa(“FXa”)抑制物比较,它的出血更少。另外,FVIIa/TF抑制在预防球囊损伤后的新生内膜增厚以及血管狭窄上优于其它的抗凝剂(例如肝素,FXa抑制物)。
血栓调节蛋白(“TM”)是一种跨膜糖蛋白,它具有抗凝性质并且主要表达于血管的内皮细胞的管腔面(lumenalsurface)(Esmon,.(1982)(2)859-864;Salem,.(1983)(19)12246-12251)。成熟的全长TM是一种557个氨基酸残基的调节蛋白,它由5个结构域组成一个N末端疏水性区域(残基1-226);一个富含半胱氨酸区域(残基226-462);一个O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸区域(残基463-497);一个疏水的跨膜区域(残基498-521);以及一个C末端的胞质尾区(残基522-557)。
富含半胱氨酸区域包括6个与表皮生长因子(“EGF”)前体同源的被称为EGF样、EGF同源或EGF结构域的重复结构。富含半胱氨酸区域可以被进一步地分成3个结构域EGF样重复1,2和3(“EGF123”,残基226-344),EGF3和EGF4之间的域间环(interdomainloop)(残基345-349)以及EGF样结构域4,5和6(“EGF456”,残基350-462)。EGF456的功能是介导凝血酶结合以及蛋白C的活化。一个研究已经表明第5和第6个EGF样重复(分别为“EGF5”,残基390-407以及
“EGF6”,残基427-462)具有结合凝血酶的能力(Kurosawa,.(1988)(13)5993-5996);另一个研究说明EGF456结构域能有效地作为凝血酶介导的蛋白C活化活性的辅因子(Zushi,.(1989)(18)10351-10353)。富含Ser/Thr结构域增强了EGF456介导的凝血酶的结合。第三个EGF样重复(“EGF3”,残基311-344)对于凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制物(“TAFI”)的活化是必需的。已经描述了一些EGF3的点突变影响了TAFI的激活(Wang,.(2000)(30)22942-22947)。凝血酶/TM复合物将蛋白C转化成活化蛋白C(“APC”),其依次降解因子Va和VIIIa,从而阻止进一步生成凝血酶。因此,TM作为一种将凝血酶从前凝血剂(procoagulant)转化为抗凝剂的分子开关。
当TM定位于膜表面时,蛋白C对凝血酶/TM复合物的Km减少10倍(Esmon,.(1995)(10)946-955)。血液中的蛋白C的浓度()显著地低于所报道的对可溶性TM/凝血酶复合物的Km(5μM),因此证实促凝膜表面的TM将造成蛋白C生成速率的显著的局部增强。
TM通过不同于肝素或其衍生物的机制抑制血栓形成。肝素是一种抗凝血酶III的辅因子并通过抗凝血酶III依赖性机制抑制FXa和凝血酶。血栓部位的凝血酶(thrombus-boundthrombin)
不受抗凝血酶III的影响,这限制了肝素或低分子量肝素(“LMWH”)对已存在的血凝块的抗血栓作用。这解释了在非人灵长类动物的研究中肝素或LMWH抑制血凝块部位的凝血酶或凝血酶原酶所触发的血栓生长的失败。相反,重组TM以剂量依赖性方式减少了血凝块诱导的凝血酶的生成以及纤维蛋白的形成(Mohri,.(1998)(6)925-929)。抗蛋白C抗体消除了TM的抑制作用。抑制血凝块部位的促凝活性是临床相关的,因为血凝块部位的促凝活性造成更快速的血栓生长并最后造成血管阻塞或血栓栓塞并发症。血栓生长的抑制使得内源性纤溶系统可以更快速更完全地清除血凝块。另外,在例如DIC的血浆抗凝血酶被耗竭的病理状态中,也预计TM比肝素更为有效。虽然TM和肝素在试验性DIC中都抑制了血小板和纤维蛋白原的消耗,但当抗凝血酶III水平被耗竭时,只有TM是有效的。
发明简述本发明提供了作为抗凝剂的新的融合蛋白,它包含一种与组织因子(“TF”)或与因子VIIa/组织因子(“FVIIa/TF”)复合物相互作用的靶向蛋白,其可操纵地连接到单独的或组合有至少一种其它的TM结构域的血栓调节蛋白(TM)EGF456结构域上,其它的TM结构域选自由N末端疏水性区域结构域、EGF123结构域、EGF3和EGF4之间的域间环、O-糖基化的富含丝氨酸/苏氨酸结构域,或其类似物、片段、衍生物或变体组成的组中。
本发明的抗凝血融合蛋白在损伤部位靶向并结合TF或FVIIa/TF复合物,将TM定位于损伤部位,并因此防止血栓形成,以及比较于可溶性的抗TF抗体或可溶性TM或TM片段,它是一种更为有效的抗凝剂。融合蛋白在治疗包括但不限于脓毒症、弥漫性血管内凝血、缺血性卒中、深静脉血栓形成、急性冠脉综合征、血管成形术后的血栓并发症以及进行性癌症的凝血病的某些疾病时比低分子量肝素(“LMWH”)更为有效。另外,融合蛋白也可应用于微血管手术、皮肤和静脉移植以及器官移植。
另一方面,本发明提供了包括目标融合蛋白的药用组合物。
另一方面,本发明提供了一种预防患者血栓形成的方法,包括施与上述患者治疗有效量的融合蛋白,从而抑制了凝血酶的形成而不直接影响其它的凝血参数,例如血小板的活化和聚集。
另一方面,本发明涉及一种用于预防及治疗患者的深静脉血栓形成(“DVT”)或弥漫性血管内凝血(“DIC”)或急性冠脉综合征或具有凝血病的癌症的方法,包括施与所述患者治疗有效量的融合蛋白。
另一方面,本发明涉及一种调节患者的炎症反应的方法,包括施与所述患者治疗有效量的融合蛋白。
仍在另一方面,可用本发明的融合蛋白在与血液接触的医学器械表面形成一层非成血栓性包膜。
另一方面,本发明涉及一种包含融合蛋白的试剂盒,该融合蛋白包含与TF或FVIIA/TF复合物结合的靶向蛋白,以及TM结构域。或者,所述试剂盒可包含编码融合蛋白成分的DNA序列。
本发明也阐述了制备本发明融合蛋白的方法,重组和合成方法。
(TF)3e10与sTF的结合增加了sTF对FVIIa的表观亲和力(apparentaffinity)。在有和无800nMscFv(TF)3e10时,利用2nMFVIIa如实施例5“sTF/FVIIa活化检测”所述进行sTF/FVIIa活化检测。将sTF滴定到测定物中并测定出显色底物(S-2266)的裂解速率。用标准的4-parameterfit计算出sTF的表观KD。
(TF)3e10对sTF的结合亲和力的测定。sTF/FVIIa检测如实施例5“sTF/FVIIa活化检测”所述利用3nMsTF和2nMFVIIa进行。所用的sTF浓度低于与FVIIa结合的KD。与scFv(TF)3e10抗体的结合降低了sTF与FVIIa结合的KD,导致sTF/FVIIa复合物生成的增加,并因此加快了显色底物S2266的裂解速率。以逐渐增加的浓度加入scFv(TF)3e10并利用标准的4-parameterfit用增加的反应速度确定抗体对sTF的表观KD值。
(TF)3e10对sTF/FVIIa复合物的亲和力比对单独
sTF的亲和力高出20倍。利用MicroCalVP-ITC设备进行等温滴定量热法。。用尺寸排阻层析确认sTF被完全结合。对于抗体对复合物的亲和力的确定,(TF)3e10抗体加入到注射器中。对于抗体对单独sTF的亲和力的确定,将10μMsTF加入到孔内并将141μMscFv(TF)3e10加入到注射器中。用MicroCalOrigin软件进行数据分析。数据适合于单个结合位点。
(TF)3e10剂量依赖性地抑制FX活化检测。在实施例5“因子X活化检测”中描述了该检测的细节。IC50代表达到50%最大抑制所需的剂量。
。进行凝血酶原时间(PT)检测以比较融合蛋白与TF抗体或单独的TMi456。将适当体积的浓缩的抑制物或TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)加入到100μl重组人组织凝血酶原激酶(OrthoRecombiplastin)中。约2分钟后,加入100μl重构人血浆。在Haemoliance测凝计上确定凝血时间。生成每种抑制物的剂量效应曲线以及用回归分析计算出延长凝血时间2倍所需的浓度(nM)。
。在实施例
5“蛋白C活化检测(显色法)”中所描述的检测含有20μlTM标品,或含有EGF结构域4-6及EGF3和EGF4之间的域间环的TMi456,或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456),。活化进行1小时。。然后加入100μllmMS2266并每10秒钟测定A405共30分钟。反应速率依赖于生成的活化蛋白C的量。数据用mOD/min表示。
。加入TF小泡(vesicle)不影响TMi456活化蛋白C的速率。在实施例5“蛋白C活化检测(在富含TF表面)”中所描述的检测含有20μlTM标品,或TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456),,20μl的3nMα凝血酶以及20μl的缓冲液或TF小泡(Innovin,人重组TF,4x用于PT的正常浓度)。活化进行1小时。。然后加入100μl1mMS2266并每10秒钟测定A405共30分钟。反应速率依赖于所生成的活化蛋白C的量。数据用mOD/min表示。
图8融合蛋白显示出比TMi456更高的对TF诱导的凝血的特异性。活化的部分组织促凝血酶原活酶时间(APTT)检测对内源性和凝血中心途径的抑制物是敏感的。在该检测中所发生的凝血与TF无关。将抑制剂,TF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)稀释到50μl重构的人血浆中,其终浓度使得
PT检测延长了2倍。然后往测凝计加入50μlAPTT(AlexinHS)试剂和50μlCaCl2试剂(),并按秒测定凝血时间。
。利用HaemoscopeThromboelastogragh(TEG)分析仪分析全血凝血。将120nMTF抗体(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)与10μl组织促凝血酶原激酶试剂(1∶64稀释)。得到每个标本的R值(到开始形成纤维蛋白的时间)。然后将该值转化为未抑制的对照R值的a%。
(TEG)上示出比LMWH更多的预期的剂量效应。将逐渐增加浓度(从15nM开始并以2x增量增加)的融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)或逐渐增加浓度()的依诺肝素(LMWH)与10μl组织促凝血酶原激酶试剂(1∶64稀释)。得到每个标本的R值(到开始形成纤维蛋白的时间)并绘制出对相对浓度的曲线(将每个标品的最低浓度设定为1(相似R值),然后以2x增加之后的浓度)。
(TF)3e10-TMi456在弥漫性血管内凝血(DIC)的体内模型中是有效的。在实施例8所述的大鼠血栓栓塞模型中评价了